金黄色葡萄球菌δ溶血素分泌特点的初步研究.docVIP

　　金黄色葡萄球菌δ溶血素分泌特点的初步研究 【摘要】　　目的通过检测不同金黄色葡萄菌菌株不同时间点δ溶血素的分泌，观察其分泌的特点，为进一步的研究打好基础。方法采用高效液相色谱法（HPLC）检测不同菌株、不同时段的δ溶血素的分泌量，绘制其与生长时间、细菌生长量的关系曲线。结果在检测的8株金黄色葡萄菌中，δ溶血素的分泌存在着明显的菌株间的差异；其分泌的量时间曲线呈现“S”型，可分为分泌量微量增加、快速增加、平缓增加三个时期。结论δ溶血素的分泌反映了金黄色葡萄球菌密度感应系统（agrsystem）调控外毒素分泌的特点。 【关键词】δ溶血素　金黄色葡萄球菌　高效液相色谱法 　　【Abstract】ObjectiveForthefurtherstudy,pttoacquaintourselvesolysininstaphylococcusaureus.MethodsTheamountofδhemolysinfromdifferentstrainsandgroanceliquidchromatography(HPLC)andthecurveoftheamountofδhemolysinvsgroeolysinisvariousindifferentS.aureusstrainsanddifferentgroolysinsecretionissynchronousolysininS.aureus. 　　【Keyolysin,staphylococcusaureus,HPLC 　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）是人类主要的致病菌之一［１］，可引起败血症、毒素休克综合征（TSS）、心内膜炎、泌尿道感染、皮肤脓肿、食物中毒和伤口感染等，其致病性主要是因其能分泌20多种蛋白毒素。其中大部分蛋白毒素的合成主要受一个被称为“数量阈值感应”系统（quorumsensingsystem，QS）的调控［2］。在金葡菌中，该系统由agr基因座（accessorygeneregulatorlocus）编码，称agrsystem，近年来成为细菌毒素分泌调节研究［3］及新型抗菌药物研发的热点［4，5］。 　　δ溶血素（δhemolysin）是致病性金葡菌产生的四种重要的溶血素之一，其分泌的变化情况可间接反映agr系统的活动情况［6］。 　　本研究的目的是首先建立在我们的实验系统下用HPLC检测δ溶血素的方法，其次观察δ溶血素在不同菌株，不同生长时段的分泌情况，为更深层的研究打好基础。 　　1材料与方法 　　1.1主要仪器及试剂AKTApurifier色谱仪（AmershamPharmaciaBiotech），紫外检测器（UV900），ResourcePHE1ml色谱柱（AmershamPharmaciaBiotech），低温离心机（AvantiJ25,Beckmancouter），乙腈（SigmaAldrichLaborchemikalien），tryptone（Oxoid），yeastextract（Oxoid），其它均为国产分析纯。 　　1.2菌株及生长条件金黄色葡萄球菌ATCC29213（耐青霉素的标准菌株），BAA42（耐甲氧西林MRSA），均购自ATCC（AmericanTypeCultureCollection），其它株为华西医院临床分离的MRSA菌株，采用BM（basicmedium）培养基：10g/Ltryptone，5g/Lyeastextract，5g/LNaCl，1g/LGlucose，1g/LK2HPO4。我们的培养体系为：过夜培养菌液按1∶100的比例接种到新鲜BM培养基中培养（初始菌量约为5×107CFU/ml，三角烧瓶与培养基体积比为10∶1）,37℃，210r/min振荡培养。以下实验均按此体系进行培养。 　　1.3HPLC实验条件的建立 　　1.3.1样品的制备：将金黄色葡萄球菌按上述条件培养8h，取菌液，19000r/min离心5min，上清经0.22μm过滤，进行HPLC分析（从离心至上样分析的各步操作均在冰上进行）。 　　1.3.2洗脱条件的优化：参考MichaelOtto的方法［7］。缓冲液A为1ml/L三氟乙酸（TFA）/100ml/L乙腈（acetonitrile），缓冲液B为1ml/LTFA/900ml/Lacetonitrile。采用0%～100%B的线性梯度洗脱，根据洗脱曲线调整洗脱条件，达到最佳分离。 　　1.3.3上样量的确定：先以1ml为经验上样量，然后根据不同菌株各自的检测结果调整上样量。 　　1.4金黄色葡萄球菌生长曲线与δ溶血素分泌时间曲线的绘制接种金黄色葡萄球菌后，每隔1h取2ml菌液,其中10