51 基因工程菌的培养.pdfVIP

第5章 基因工程菌的发酵 基因工程： • 又称DNA重组技术，以分子遗传学位理论基础，运用 体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助 于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新 的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和 表达。 • 经重组DNA技术改造得到的菌株即为基因工程菌。 工程菌应具备的条件 ① 发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分 泌型菌株。 ② 菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 ③ 菌株不是致病株，也不产内毒素。 ④ 代谢控制容易进行。 ⑤ 能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不 易脱落。 基因工程菌的构建 1 ）目的DNA的获得 ① PCR扩增 ② 克隆文库筛选 ③ cDNA反转录 ④ 合成 基因工程菌的构建 2 ）目的DNA与载体连接 ① 黏末端连接 ② 平末端连接 ③ 人工接头 基因工程菌的构建 3 ）重组基因导入宿主细胞 ① 化学转化，Ca2+ ② 电转化，电穿孔 ③ 接合转化 ④ λ噬菌体转染 ⑤ 农杆菌，根癌农杆菌、发根 基因工程菌的构建 4 ）重组子的筛选鉴定 ① 抗药性标志的筛选 ② β －半乳糖苷酶系统筛选 ③ 分子鉴定 1 ）基因药物：细胞因子、疫苗 基因工程菌的应用 2 ）发酵产品：酶制剂、抗生素等 3 ）环境治理 5.1 基因工程菌的培养 • 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程 菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程 中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。 5.1.1 基因工程菌培养的安全性 • 关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。 经过重组的菌和质粒一旦用于，工业化生产，就不可避 免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治 疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其 重要的。 • 1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的 问题。后来，美、日等国都制定了有关DNA重组实验 的准则。 • 这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据 对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学 密封(B1和B2)两种方法。 • 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验 人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封 由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程 度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高 。 • 生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿 主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组 合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封 程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。 • 企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS-1和LS-2。 LS-2相当严格，工业生产起码应在LS-1的设备标准下 培养。LS-1标准要点是：(1)使用防止重组菌体外漏， 能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置；(2)培养装 置的排气由除菌器排出；(3)使用易产气溶胶的设备时 ，要安装可收集气溶胶的安全箱等。 • 设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂 菌的侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培养后的菌 体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用 密闭型的设备。 5.1.2 基因工程菌培养的特点 ① 基因工程细胞工业化培养中，产物的产率往往比实验 室培养规模为低。 其原因主要与基因工程细胞特点有关，首先基因工程细胞的生长 速率及表达率与其所载外源DNA的稳定性及产物分泌过程有关， 其中重组DNA的稳定性尤为重要，重组DNA在宿主内表达方式 有两种，其一是游离表达方式、其二是结合表达方式。因此，基 因工程细胞培养过程，重组DNA的丢失方式亦有两种，其一是细 胞培养过程，由于回复突变或分配作用致使DN