竞争定量RTPCR检测铜对猪垂体GHmRNA表达水平的影响论文.pdfVIP

124 肚科学发展观促进科技创新(上) 李家奎 华中农业大学动物医学院，湖北武汉，430070 摘要 采用竞争定量RT—PCR检测铜对猪垂体GHmRNA表逸水平的影响。45头体 重20kg左右的“军牧1号”白猪，分成A、B、C组，C为对照组，饲以基础日粮，A、B分别饲以添 水平的影响。结果表明：目粮中添加两种水平铜均能促进仔猪的生长，提高饲料利用率提高垂 体GHmRNA表迭水平。铜对猪的促生长作用是通过提高垂体GHmRNA表达水平近而促进 GH的合成与分泌实现的。 关键词铜猪竞争定量RT—PCR基因表达 铜作为生长促进剂在养猪生产中普遍应用。但由于通过猪肠道的铜绝大部分不被吸收而排出体 外，由此所造成的环境污染和资源浪费已日益引起广泛关注，因此研究铜促进猪生长的机理，降低铜添 加的水平，对于减少高铜所造成的危害和开发新型的生长促进剂具有十分重要的意义。目前的研究表 明，高铜促进猪生长的铜与抑菌作用、增加采食量、提高含铜酶的活性、调节内分泌功能等因素有关。研 究表明高铜有提高猪垂体GHmRNA水平的趋势，但同时指出该结论尚需采用更为精确的方法验证。 为此，本研究以断乳“军牧1号”白猪为试验对象，探索铜促进猪生长的适宜浓度，并采用竞争定量PCR 方法研究高铜对猪垂体GHmRNA水平的影响，研究铜促进猪生长的机理。 一、材料与方法 (一)材料 II(LifeTechnoIo— 硫酸铜(化学纯，上海绿源化工公司)，Trizol(Invitrogencompany)．SuperScript DNA gies，Gibco)，LATaq polymerase(TaKaRa，Japan)，dNTP(上海生工)等。 (二)试验动物 “军牧1号”白猪45头，体重20kg左右，雌雄不拘。试验日粮按仔猪营养需要配制成颗粒饲料，配 方和营养水平见表1。 (三)试验方法 1．饲养试验 实验猪编号，常规免疫、驱虫，随机分成A、B、C三组，每组15头，调整各组体重无差异，预试3d。C 组为对照组，饲以基础日粮；A、B分别于基础日粮中添加125mg／kg、250mg／kg硫酸铜。实验进行35d， 实验期间猪只自由采食饮水。实验过程中记录猪的采食情况，实验终了，空腹称重，测定猪的生长性能， 每组各取三头猪宰杀，无菌采集垂体，液氮冻存，备用。 以科学发展观促进科技创新(一) 125 2．垂体GHmRNA表达水平的检测采用竞争定■PCR方法 3000测定RNA浓 (1)垂体总RNA的提取和反转录采用Trim[一步法提取总RNA，SpmartSpec 度，以A mmol／LdNTPs ddH：O使反应体积为9pL，70℃lOmin后立即冰浴，加入5×RT缓冲液4,uL，2．549L， II 逆转录酶SuperScript 冰浴后一20℃保存cDNA． 一对引物，上游引物：5 其克隆于pMD一18T 竞争模板，扩增竞争模板，回收产物，测定浓度，稀释备用。 buff— er，1．5mm01]LMgCl2 dNTP 2vL，0．2mmol／L agDNA 应体系中加入竞争模板0．02ng。PCR反应在Tpermr,212000 后，取5txLPCR产物在2．0％EB染色的琼脂糖凝胶上电泳。图像处理及灰度分析采用GelDoe2000TM凝 胶成像分析系统，根据模板和竞争模板PCR产物的灰度比，确定样品GHmRNA表达水平。 (四)数据处理 ANOVA(方差分析)进行统计分析。 裹1基础日粮组成殛曹养水