抗肿瘤药物筛选.pptVIP

步骤： （1）制备单细胞悬液； (2)对细胞计数后接种于96孔板，一般5000个/孔（可先做细胞倍增试验确定每孔中最佳细胞数）； （3）将培养板放入CO2培养箱，过夜培养； （4）24h后更换培养基，并在每孔细胞中加入不同浓度药物，继续培养； （5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培养3-6h,停止培养，弃取培养基,加入DMSO，每孔150ul，轻微震荡混匀； （6）把96孔板放入酶标仪中，490nm测定吸光度。 注意：设好对照 3.抗代谢法 抗代谢物在无机氮源的合成培养基中显示抗菌作用，而在普通有机氮源的营养培养基中无抗菌作用（因为有机氮源可将具有抗菌作用的物质代谢），利用此特点，选择无机氮源试验有抗菌作用的物质，作为抗代谢的初筛方法。  常用宿主动物： 裸小鼠 （“活的试管”） 特点：先天无毛，无胸腺，T淋巴细胞功能 完全缺失，对异种移植不产生排斥反应。 缺点：费用高，饲养条件高，不宜大量繁殖。 一般不用于初筛。 应用：观察药物对癌细胞逆转作用， 抑制增殖及诱导凋亡作用。 C57BL/6小鼠 特点：黑毛，体型小，性情温顺， 易饲养，药敏性好，为研究 Lewis肺癌首选。 应用：药物体内初筛。 模型建立方法 实体瘤建立 1.小块瘤体接种法 2.肿瘤细胞悬液接种法 3.培养细胞移植法 治疗方案：接种后生长至可触及即可治疗，依药物特性及研究目的确定方案，可给药一次，或连续几次，或一周几次连续几周。 疗效评价： 肿瘤抑制率＝（对照组瘤重－给药组瘤重）/对照组瘤重×100％ 六 基因芯片技术 2.基本技术路线 ①基因的选择与实验设计 　　根据表达谱数据库选择5000-10000个与发育及疾病相关的基因，制备药物筛选芯片。 ②芯片的制备 ③细胞的培养与药物刺激 　　根据目的药物及表达谱芯片数据库中细胞表达谱选择适当的细胞系，用适当计量的药物加入细胞培养液中，不同的时间取样，抽提刺激前后的mRNA。 ④大白鼠饲养与药物刺激　　用常规方法饲养大白鼠，用适当剂量的药物喂养大白鼠，不同的时间取大白鼠的适当器官（根据所筛选的药物而定），抽提刺激前后的mRNA。 ⑤刺激前后的mRNA的制备及标记 ⑥芯片杂交及扫描 ⑦数据分析及生物信息学分析 　　用表达谱数据库及配套软件分析受药物诱导的基因，针对这些基因的功能确定药物的疗效。 五 动物模型 整体动物实验法是评价一个药物是否有效的最主要方法 整体动物在肿瘤药理学研究中的作用： 1.研究新开发药物对肿瘤的防治作用； 2.抗肿瘤药物筛选及抗肿瘤机理探索； 3.探索药物和目前常规肿瘤治疗方法的 综合应用以提高疗效。 腹水瘤建立及评价： 评价：对照组通常2-3周内死亡，治疗组一般观察50d左右，计算生命延长率。 生命延长率＝（治疗组平均存活天数－对照组平均存活天数）/对照组平均存活天数×100％ 注意事项： 1.取材时取实质部位，不要取坏死、液化部位，防止污染。 2.试验前先饲养裸鼠一周，以适应新环境，若死亡超过10%不可用，一般18-22g，4-6周龄。 3.饲养环境及鼠笼、垫料、饲料严格消毒 4.保持恒温，一般25±1℃，湿度40-60%，每天10h光照、14h黑暗。 1 3 5 7 9 11 13 15 days Tumor Valume (mm3) A C a b c d B a b 1.原理 是一种建立在杂交测序基本理论上的全新技术，它利用固定在芯片上的几万至几十万条探针与样品进行杂交，在一步实验中获取大量的信息。 * * * * * * 抗肿瘤药物筛选 侯桂琴 郑州大学药学院 内容提要 一 细胞筛选 二 微生物学筛选方法 三 精原细胞法 四 利用分子靶点筛选 五 动物模型 六 基因芯片技术 一 细胞筛选 筛选方法 1.四氮唑蓝（MTT）还原法 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 实验组光吸收值（A） 细胞存活率= ×100%