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第44卷第2期 东 北 农 业 大 学 学 报 44(2)：53-58 2013年2月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity Feb．2013 脆壁克鲁维酵母基因置换技术的建立 李 杰，曹宇婷，徐 欣，张 旭，李 璐，吕 洋，卢松冲 (东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030) 摘 要：以中性乳糖酶生产茵脆壁克鲁维酵母为材料 ，构建以kan基因为筛选标记、以脆壁克鲁维酵母乳糖 酶基因上游调控区为同源臂的质粒pPkan。将质粒pPkan电击转化脆壁克鲁维酵母，对受体茵生长时期、电场强 度、电击后培养时间等条件进行优化。结果表明，以0D 为0．8的脆壁克鲁维酵母为受体、电压 1．5kv、电场强 度为7．5kV·cm-、电击后培养时间为90min，可获得较高的转化率，最高转化效率为2．37~10转化子 ·I~gDNA。在 电击转化的同时加入限制性内切酶l0 L，对电击转化的转化率无显著影响。经PCR筛选证实87．5％的转化子为同 源重组，从而建立一套有效的脆壁克鲁维酵母基因置换技术。 关键词：脆壁克鲁维酵母；电击转化；限制内切酶介导；同源重组；基因置换 中图分类号：Q一31 文献标志码：A 文章编号：1005—9369(2013)02—0053—06 李杰，曹宇婷，徐欣，等．脆壁克鲁维酵母基因置换技术的建立J【】．东北农业大学学报，2013，44(2)：53-58． LIJie，CAOYuting，XUXin，eta1．EstabishmentoftechniquesforgenereplacementinKluyveromycesfragilis[J]．Journalof NortheastAgriculturalUniversity,2013，44(2)：53-58．(inChinesewithEnglishabstract) Estabishmentoftechniquesforgene replacementin Kluyveromyces fragilis／uJie，CAOYuting，XUXin，ZHANGXu，LILu，LVYang，LUSongchong(SchoolofLife Sciences，NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030，China) Abstract：Toestibishthehomologousrecombinationandelectroporationsystem inKluyverom— ycesfragilis．weconstructedtheplasmidpPkanwascoustuctedwhichwithHomologousarmsoftheUAs0f lactasegenefrom lactaseproductstrain．Paperstudiedtheeffectsofgrowthphaseofceils．electricpara- meters，culturedtimeafterelectroporationontransfomr ationefficiency．Atthe sametime，westudied the relationthatoc mbinedtheelectroporationwithREMI．Theresultindicatedthatanefficientandstablesystem of electroporationinKluyveromycesfragilishadbeendeveloped，providingapowerfultoolforthetransgenic researchofKluyveromycesfragilis．Theresultsshowedthatahightransformationefficiencywasachievedin Kluyveromycesfragilisce