荧光原位杂交技术的原理及其应用a1.pptVIP

切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。 该方法使用时应注意： A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小 B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎，不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口 C. 标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行 1、不但可用于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记 2、操作简单 3、标记率高 末端标记 直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加上标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行，所以称之为末端标记。 经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外，更多的用于RNA S1作图以及引物延伸反应中的标记引物。 变性后的探针DNA或RNA与随机引物混合 随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合 DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物3’-OH端开始合成互补DNA链 反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针 * Human cell with an apparently reciprocal chromosome translocation (arrows) detected by fluorescence in situ