Allprep组织细胞RNADNA分提试剂盒操作方法及步骤说明书.doc

◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册◆ 实验室使用，仅用于体外◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册◆ 实验室使用，仅用于体外◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册◆ 实验室使用，仅用于体外 目录号：RN适用范围： 适用于提取总RNA试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 50次(RN290) 裂解液RLT室温 50 ml 去蛋白液RW1 室温 40 ml 漂洗液RW 室温 10ml第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温 10 ml 70%乙醇 室温 9ml RNase-free H2O第一次使用前按说明加指定量乙醇 室温 5 ml 漂洗液W室温 1ml第一次使用前按说明加指定量乙醇 室温 10 ml 室温 50套 吸附柱RA和收集管 室温 50套 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。储存事项： 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。 不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 注意事项 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 x106细胞x106，组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。 裂解液RLT 去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 预防RNase 污染，应注意以下几方面： 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。 RNA 在裂解液RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。） 关于DNA 的微量残留： 一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留本公司的，由于采取了本公司独特的缓冲体系和，如要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR我们建议在进行模板和引物的选择时： 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。 RNA 纯度及浓度检测： 完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。 纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。 浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示： 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指