基因工程-23分子的杂交.ppt

第一章 基因工程的主要技术原理 第三节 核酸的分子杂交 起源于标准的光学显微镜技术，这种技术曾被用来观察细胞分裂期的染色体形态。 对于许多生物体来说，可以通过染色体的形状或者不同方法的染色来区分。 原位杂交提供了一种通过在光学显微镜下观察染色体的图像，直接定位克隆基因的方法。 原位杂交的优点 不仅能够鉴定出基因存在于哪条染色体上， 还可以提供染色体上基因位置的相关信息。 特点： 原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品， 可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 经固定剂处理的细胞被黏附在载玻片上，然后用核糖核酸酶和氢氧化钠降解RNA，并使DNA分子变性，单个多聚核苷酸链之间的配对碱基被拆散，而且染色体也在一定程度上被拆开，暴露出通常被包裹在它们结构之中的DNA片段。 将一定量的被标记的基因掺入到制备好的染色体中。 标记基因和它的染色体拷贝杂交，最终在放射性自显影中形成一个黑点。这个黑点的位置表示标记的基因在染色体上的位置。 尽管技术较难，但人们已经利用原位杂交和放射性标记的探针，定位人类细胞遗传图谱上相当数量的基因。 人们用荧光标记物替代放射性标记，将它连接到杂交探针上，探针与DNA分子杂交后，可以通过荧光显微镜直接观察实验结果。如果使用不同的荧光染料，可以同时探测两个或更多的基因，通过荧光颜色间明显的差异可以分辨出不同的杂交信号。 FISH经常与已知正常染色体位置的探针一起使用，这项技术对于研究染色体已经重新排列的细胞特别有用。 染色体重新排列，例如染色体复制，或者是某一DNA片段从一条染色体转移到另一条染色体上，都能够通过FISH相对较快地测定出来，比传统的染色技术快很多。 2.1 杂交样品膜的制备 1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜 (Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（20,000） 2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点：能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同探针进行多次杂交分析。 该类基质结合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 4）离子膜 i. DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制备回收) ii. CM-纤维素纸 (可用于碱性蛋白质的结合) 固定基质的选择依据 1）强度，耐久性，操作简便 2）高信噪比（低本底高信号） 3）生物大分子的结合容量和稳定性 4）重现性好 ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。 地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。 3) 两类标记化合物的比较 i. 灵敏度 检测蛋白质，两种方法差不多。 检测核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 稳定性 酶法探针可在4℃保存一年，放射性标记需每次制备。 iii. 安全性 非放射性标记安全。 iv. 效率 非放射性标记所需时间短。 2.4 分子杂交与结果检测 1. 核酸杂交与结果检测 1）预杂交： 预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是cDNA或RNA，预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合, 42℃ 4-6h或过夜。 2）杂交：探针100℃变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42℃一天 4）放射自显影或显色反应 使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。 若采用非放射性同位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。主要有两种酶： i. 辣根过氧化物酶: 可将3，3’-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将4-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。 2. 蛋白质的免疫分析 封闭剂，明胶，牛血清蛋白，卵清蛋白等。 i. 阳离子尼龙膜（如Zeta-prob，Zeta-bind等） i) 容量大, 蛋白质可结合480μg/cm2 ii) 可结合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白质。 iii)韧性好 iv) 可用于电转移 v) 可进行反复多次杂交试验 vi) 广泛的化学耐受性和可高温消毒 *不能用于蛋白质的直接染色 ii. 尼龙66 广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态。 3) 尼龙膜 核酸杂交常用几种膜的性能比较 尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤： 1. 核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用 2. 印迹杂交