实验用五指山小型猪胚胎生殖细胞的分离培养.pdfVIP

第25卷 第 5期 实验动物科学 Vo1．25 No．5 2008年 10月 L BORAT0RY ANIMALSCIENCE October2oo8 驴 抄 驴 研究 ·论著 、 、 护 、： 、‘舻 实验用五指山小型猪胚胎生殖细胞的分离培养 刘 岚 牟玉莲 冯书堂 (中国农业科学 院北京畜牧兽 医研究所 ，北京 100094) 摘要：目的 对从猪 的原始生殖细胞分离获得胚胎干细胞 的方法进行初步研究。方法 胎儿取 自怀孕 26～28d的 实验用五指 山母猪。分离胎儿生殖嵴获得 PGCs，接种于 STO饲养层上 ，以DMEM +2mmol／L谷氨酰胺 +0．1mmol／L 非必需氨基酸 +0．1mmol／L 巯基乙醇 +100IU／mL青霉素+100gg／mL链霉素 +15％FCS作为培养基，对细胞进行 培养传代。结果 培养的细胞传至4～5代，形态多样，经AKP染色、SSEA一1免疫荧光染色、Oct一4免疫荧光标记等 方法鉴定为阳性，具有胚胎干细胞的特征 。 关键词 ：胚胎生殖细胞 ；原始生殖细胞 ；五指 山小型猪 中图分类号 ：Q954．45 文献标识码 ：A 文章编号：1006—6179(2008)05—0020—04 胚胎生殖细胞 (embryonicgermcells，EGcells)是 1．2 实验方法 从胎儿原始生殖细胞 (primordialgermcells，PGCs)分 1．2．1 基础培养液 ：DMEM(Gibco)+15％ FCS 离培养出来的具有发育全能性或多能性的细胞。与 (Gibco)+2mmol／mL谷氨酰胺 (Gibco)+0．1mmol／ 来源于早期胚胎 内细胞 团(innercellmass，ICM)的 mL非必需氨基酸 (Gibco)+0．1mmol／mLJ3一巯基乙醇 ES细胞 (embryonicstem cells)统称为胚胎干细胞 。 (Sigma)+100IU／mL青霉素 (Sigma)+100~g／mL链 EG细胞与Es细胞一样 ，具有与早期胚胎相似的形 霉素 (Sigma)。 态特征 ，具有高度 的发育潜能和广泛的分化能力 ，具 1．2．2 饲养层 的制备 ：选择生长旺盛且形态 良好 有生殖系嵌合能力和种系传递功能，可以在体外无 的STO细胞用 10t~g／mL丝裂霉素 C(Sigma)处理2～ 限增殖 ，可以在体外进行遗传操作。胚胎干细胞在 3h，然后倒掉丝裂霉素 C，用无 ca2、Mg2 PBS冲洗 生命科学基础研究、临床医学及畜牧业生产上均具 3～5次 ；加入胰蛋 白酶消化成单细胞悬液，调整浓 有广泛的应用价值。 度后 以3×10／mL的密度接种于培养板 中，放人 实验用五指 山小型猪 (WZSP)具有诸多分子遗 37℃、5％CO，培养箱中培养备用。 传学种质特异性，其血液生理生化指标、解剖生理及 1．2．3 PGCs的分离与原代培养 ：无菌条件下，摘除 器官大小等均与人类非常相近 ，因此 ，五指山小型猪 妊娠 26～28d母猪子宫，取 出包有完整胎膜 的胎 胚胎干细胞系的获得能够为人类遗传疾病动物模型 儿 ，用加双抗 的无 ca2、Mg2PBS液清洗后去除胎 的建立及我国的转基 因猪等研究工作提供重要的基 膜 ，将胎儿用无 Ca2、Mg2 PBS液洗干净 ，仔细去除 础材料 。