活体内生物检测.ppt

* FRET的全名是Fluorescence Resonance Energy Transfer ，螢光共振能量轉移（FRET）是一種螢光光譜技術，可以用來量測分子間的距離。原理是利用供體及受體兩個螢光分子，當供體的發射光譜與受體的激發光譜有重疊時，在兩分子距離極為接近的情況下，供體由激發態躍遷所釋放出的能量將轉而激發受體，這種能量轉換是一種雙原子偶極力作用(dipole-dipole interaction)。FRET的有效範圍約從20~100?，也就是說，我們可以用光學的方法準確地量測光學解析度以下的尺度。此外，FRET也被有效的應用於生物分子現象的研究。然而使用FRET必須先滿足三個基本條件：第一、供體的放射光譜與受體的吸收光譜有明顯的重疊；第二、供體與受體之間有一定的距離限制，有效範圍在20~100?；第三、供體與受體各別的螢光蛋白彼此容易配合。此外，實驗者亦可經由增加供體的放射光譜與受體的吸收光譜兩者的重疊來改善FRET的效率。實驗中常利用的手段是應用分子生物技術讓細胞內分子表現螢光蛋白，包括綠色的BFP與黃色的CFP。若此類分子於細胞內形成聚合，即會形成提供者接受者複合物(Donor-Acceptor Complex)之關係，則會產生螢光共震能量之傳導現象而顯現出檸檬色 。 實驗設計中將哺乳類動物細胞的AHR及HSP90 DNA序列分別分離出來，各自插入能夠表現出不同螢光色澤的哺乳類動物細胞螢光表現載體，轉殖入哺乳類動物細胞，使得AHR及HSP90基因序列能夠在哺乳類動物細胞內自體(Endogenous)表現出螢光AHR及螢光HSP90蛋白質，並且期望螢光AHR及螢光HSP90蛋白質能夠於細胞中自體生成AHR-HSP90多重螢光複合物，建立能夠表現AHR-HSP90多重螢光複合物細胞株。藉由於細胞培養環境中添加不同劑量之戴奧辛，於螢光顯微鏡下觀察AHR-HSP90多重螢光複合物的解離作用是否有程度上的差異。由於觀察AHR-HSP90多重螢光複合物能夠於分子內產生FRET，螢光共振能量傳遞的現象，因此細胞培養環境中若有戴奧辛的存在，可藉由戴奧辛訊息傳遞路徑造成AHR-HSP90複合物的解離，使得分子內的FRET現象消失，進而轉而變成AHR與HSP90相互獨立存在的螢光。並且依據環境中存在戴奧辛濃度的不同而造成AHR-HSP90複合物分子內的FRET現象消失程度上的差異，觀測戴奧辛對此轉殖後之哺乳類細胞有無梯度依賴的影響。目前我們已針對此項原理，證明可以偵測檢體中之戴奧辛，並已成功發表兩篇報告，目前正申請專利中。 * 因此，綜合本次演講內容，我們可以歸納戴奧辛生物檢測法的優勢與目標如下： 操作容易、成本低廉、效率性高 快速的初步評估 直接的Dioxin生物危害的評估 取代傳統檢測技術仰賴質譜儀的限制 落實於環保署農委會等單位,大幅簡化對戴奧辛之定量與定性手續 * 許多環境污染因子對生物體的傷害極大，再加上現階段利用化學檢測方式不僅成本支出高，而且需要長時間才能得到結果，又不能夠大量處理檢體，其效率實為甚慢。建立對環境污染物之生物檢測技術實為當務之急，取決於細胞對環境污染因子的高敏感度，以及取得來源容易，降低成本支出，並且能夠同時間檢測大量檢體。細胞對環境污染因子的反應迅速也大大提昇了檢測的效率。惟生物檢測技術必須跨越生物科學與化學科學兩大領域之鴻溝，因此建立生物檢測模式的技術門檻較高。但是對於研究具有效率的環境因子生物檢測模式實在刻不容緩，因此投入環境污染因子Dioxin的生物檢測模式建立。Dioxin生物檢測的貢獻不僅是突破過去傳統Dioxin檢測在技術上的種種限制，另外更具意義的是開創對環境污染因子高效率檢測的新思維。我們認為建立Dioxin生物檢測系統的成功對現有生物危害評估工具具有革命性的歷史意義，直接對生物體進行生物危害分析才能提出最有利的科學證據。高效率低成本的Dioxin生物檢測技術實為目前迫切需要的研究技術開發焦點。 目前國內從事戴奧辛偵測之研究仍然是以質譜儀偵測法為大宗，雖然精準但個別樣品之處理成本十分昂貴，距離大幅之樣品檢測仍有相當之困難度存在。由於Dioxin於環境中存在最主要是造成對生物細胞的危害，過去使用化學分析方法評估Dioxin的生物危害是一種間接的方法。Dioxin生物檢測的貢獻是能夠提出細胞受Dioxin影響的直接反應，對Dioxin生物危害的評估更增添了直接的有力證據。除了具有毒理上專一性之外，也較化學方法更為省時且成本低廉，可以靈敏、特異地檢測出TEQ，適合於大量樣品的篩選，滿足衛生監督的需要。因此生物方法無疑將會是未來檢測戴奧辛的主流。 The End Thanks for your attendance 謝謝各位的參與 參考書目 Huang YW, Lee WS