金鱼tgf2转座酶的原核表达及其dna结合活性 - 上海海洋大学学报.pdf

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金鱼tgf2转座酶的原核表达及其dna结合活性 - 上海海洋大学学报

文章编号:16745566(2017)03033909 DOI:10.12024/jsou.20161001881 金鱼Tgf2转座酶的原核表达及其DNA结合活性 1 1 1 2 1,2 司蕊蕊 ,赵 茜 ,卢梦琪 ,邹曙明 ,蒋霞云 (1.上海海洋大学 食品学院,上海 201306;2.上海海洋大学 农业部种质资源与利用重点开放实验室,上海 201306) 摘 要:金鱼Tgf2转座子基因属于Hobo/Activator/Tam3(hAT)超家族,其编码的活性转座酶能在多种鱼类转 座中介导基因插入及诱变,因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等方面具有重要的应用前 景。鉴于Tgf2转座酶基因(JN886591)存在众多稀有密码子,本研究依据大肠杆菌对密码子的偏好性,对金鱼 Tgf2转座酶基因进行密码子优化,所得Tgf2转座酶基因连接原核表达载体pET28a(+),将重组载体转化到 大肠杆菌BL21(DE3)细胞。该大肠杆菌细胞在培养温度37℃、OD 0.5时用IPTG诱导获得高效表达,即 ≈ 600 菌体中含有8.8%的重组蛋白,上清液中含有4.0%重组蛋白。采用亲和层析纯化从菌体上清液中分离得到 分子量约70ku的可溶性重组蛋白,经MALDI(TOF)/TOF串联质谱鉴定其为重组Tgf2转座酶。进而采用分 子排阻色谱法研究转座酶的DNA结合活性,结果表明:所得重组 Tgf2转座酶能识别并结合含 Tgf2转座子特 异性亚末端重复序列的DNA探针,即启动转座。采用原核表达体系高效获得重组 Tgf2转座酶,为其作为工 具酶应用于鱼类生物学研究奠定必要的基础。 关键词:Tgf2;转座酶;原核表达;DNA结合活性 中图分类号:S917   文献标志码:A   转座子(transposon)是一类能够在基因组中 期研究显示:大肠杆菌 Rosetta(DE3)中以低温 移 动 的 遗 传 因 子,其 过 程 称 为 转 座 (22℃)、低吸光度(OD 0.3)条件下诱导,可 ≈ 600 (transposition)。随着多个基因组测序计划的进 [18] 表达可溶、活性的Tgf2转座酶 。鉴于大肠杆 行,原核和真核生物界陆续发现众多转座子,转 菌BL21菌株表达外源蛋白有更高的效率和稳定 座子因此被认为是自然界变异和进化的重要推 性,本研究根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化 [12] 并合成了金鱼 Tgf2转座酶编码区基因,与pET 动力之一 。转座子可介导基因组插入突变、 基因重排、基因修饰及基因治疗[36],因此有望开 28a(+)载体重组,采用大肠杆菌BL21(DE3)作 [79] 为宿主菌株,以期获得 Tgf2转座酶的高效表达, 发成为重要的遗传学、生物学工具 。 DNA转座子在宿主基因组通过“剪切粘贴” 为Tgf2转座酶的发酵生产及应用创造先决条件。 的机制变更位置[1011]。自主的DNA转座子能编 1 材料与方法 码活性转座酶[1213]以介导转座过程,但由于受到 来自宿主的钝化作用,迄今自然界生物体内仅发 1.1 质粒、菌种和试剂 pET28a(+)为本实验室保存;BL21(DE3)、 现极少数的天然活性转座子,如 Tol2、PiggyBac、 [1

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