家畜传染病学实验指导：布氏杆菌病的检疫.docVIP

实验十一 布氏杆菌病的检疫 目 的 初步掌握布氏杆菌病的细菌学、血清学诊断及变态反应等检疫方法。 内容及方法 家畜布氏杆菌病的检疫，即通过流行病学调查、临诊检查、细菌学检查、血清学诊断及变态反应等方法，检出畜群中的患畜。实验诊断的材料可采取胎儿、胎衣、阴道分泌物、乳汁、血液、血清、动物尸体以及马的脓肿中脓汁等。 细菌学检查 (一)染色检查 病料以绒毛叶渗出液、胎儿的胃内容物及肺脏、阴道分泌物及脓肿中的脓汁，以及培养物等制成抹片，除用革兰氏染色法染色外，应用鉴别染色法进行显微镜检查。布氏杆菌为球杆菌，0．5～0．7／lmX0．6一1．5pm，无鞭毛，不产生芽胞，不呈两极浓染，病料抹片呈密集菌丛，成对或单个排列，短链较少，革兰氏染色阴性。它虽然不是抗酸性细菌，但可以抵抗脱色用的弱酸，例如0．5％乙酸。这种特性结合布氏杆菌鉴别染色技术用于诊断有一定实际意义。下面将列出两种较常用方法。 1．改良Ziehl-Neelsen氏法 适于作胎膜和流产胎儿内容物染色之用。流产数日内取阴道拭子制作抹片，也可用此法染色。 （1）抹片晾干，在火焰上固定。 (2)用Ziehl—Neelsen氏石炭酸复红原液的1：10稀释液染10～15min(原液为碱性复红1g，溶于10ml无水乙醇中，加入5％石炭酸溶液90m1)。 (3)水洗后，用0．5％乙酸脱色15～30s。 (4)充分水洗后，用1％美蓝复染20～60s。 (5)水洗、干燥、镜检。 布氏杆菌染成红色，背景为蓝色。在胎膜抹片中经常看到布氏杆菌在染成蓝色的组织细胞中集结成团。此法对诊断绵羊地方流行性流产，胎儿弯杆菌及其他传染病也有价值。用此法染色时，胎儿弯杆菌和衣原体也染成红色，但可以从形态上区别。 2．改良Koster氏法 (1)抹片自然干燥，用火焰固定。 (2)用新配制的番红(Safranin)和氢氧化钾混合液(番红饱和水溶液2份与lmol氢氧化钾5份混合)染lmin。 (3)水洗后，用0．1％硫酸脱色10s(或在10—20s内用0．1％硫酸处理两次)。 (4)水洗后，用l％美蓝复染(3s)。 布氏杆菌呈桔红色，背景为蓝色。 (二)培养 布氏杆菌在普通培养基上虽可生长，但更适宜的是肝汤培养基，有些菌株需要有血清或吐温40(Tween 40)才能生长，所以血清葡萄糖琼脂或吐温葡萄糖琼脂被认为是较好的常规培养基。此外，有的以胰蛋白脎(Tryptose)琼脂、胰蛋白酶消化大豆(Trypticase—Soy)琼脂及AlbimiBrucellaagar(ABA)为最常用的基础培养基。在这些常用培养基内每100ml中加入放线酮(Cycloheximide)10mg，杆菌肽(Bacitracin)2 500单位，乙种多粘菌素(PolymyxinB)600单位及乙基紫最终浓度80万分之一。也可在常用培养基内加入结晶紫(最终浓度为20万分之一至70万分之一)，或乙基紫80万分之一制成选择培养基。 未经污染的材料接种于血清琼脂或肝汤琼脂上进行培养。为了抑制杂菌生长，特别是有可能被污染的材料接种于选择培养基上。同时接种两份，一份置于含有10％二氧化碳的密封容器中，以利在初分离时，需要二氧化碳的布氏杆菌生长。 (三)动物试验 在试验动物中，豚鼠用于布氏杆菌的分离检查上为最适宜。将布氏杆菌注射于豚鼠皮下或腹腔后，将发生慢性疾病，表现脾肿、肝脏与肾脏有炎性坏死小病灶。注射3～4周已能在脾脏和淋巴结中找到细菌。小鼠、家兔、大鼠也用作试验动物。病料内含菌量少而能检出的可靠方法就是接种豚鼠。如果病料污染较轻，可接种于豚鼠腹腔内，如果病料系乳汁或腐败组织，可做皮下或肌肉注射。接种乳汁时，取20ml乳样离心，将其沉淀物和乳皮层混合，接种两只豚鼠，每只接种一半混合物。每种病料至少接种豚鼠两只，一只在接种后3周剖杀，另一只在6周剖杀。剖杀前须采血作凝集反应，滴度1：5以上者为阳性。剖检豚鼠时，须注意肉眼可见病灶，如淋巴结肿大，肝的坏死灶， 脾肿大或发生结节，睾丸及附睾脓肿，四肢关节肿胀等。脾和接种部位的淋巴结以及其他 有病灶的组织均应剪碎，接种于不含抑菌染料或抗生素的固体培养基上。最好用血清葡萄糖琼脂。若剖杀前的血清凝集反应为阳性，即使剖检时的培养为阴性，也可诊断为布氏杆菌病。 血清学诊断 应用血清学方法检出血清中有抗体存在，则说明被检动物为布氏杆菌病患畜。动物感染布氏杆菌以后首先出现的是凝集抗体，再过一段时间才出现补体结合抗体，最后产生变态反应性。补体结合反应是一种高度特异性的，其阳性反应与感染的符合率，比血清凝集试验与感染的符合率高。此种方法用来鉴别注苗后和自然感染所引起的血清学反应很有价值，如4～8个月犊