家畜传染病学实验指导：蓝舌病的实验室诊断 免费.docVIP

实验二十六 蓝舌病的实验室诊断 目 的 初步掌握本病的病原学检查和琼脂凝胶免疫扩散试验方法。 内容及方法 一、病原学检查 蓝舌病病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属的成员。他与马瘟病毒和茨城病毒很相似，为 一种双股RNA病毒。目前已确认本病毒至少有24个血清型，但大多数地区是由一个或几 个血清型的蓝舌病病毒所致的。 1．病料采取 取发热早期病羊的血液，或取新鲜尸体的淋巴结、脾脏作为样品，组织，经研磨制成悬液或血液(抗凝的)进行实验动物接种，或接种于细胞培养。然后将分离到的病毒用于蓝舌病血清作琼脂凝胶免疫扩散试验或补体结合试验，鉴定病毒的种；再用分型血清作中和试验，鉴定病毒的型。也可以采取发热期和病后1个月的双份血清，用中和试验测定抗体滴度的增高情况。用血液进行病毒分离，其病毒量取决于血液样品的超声波型裂解程度。 2．直接镜检 取病畜尸体的脾、细胞培养物或鸡胚组织制成超薄切片，负染后在电镜 下观察病毒颗粒。本病毒颗粒呈球形，直径55—70nm，有双层蛋白外膜。有的报道病毒颗粒直径约100～150nm，20面体对称，有假囊膜；病毒颗粒直径为53—60nm，呈20面体对称，具有32个或42个外壳子粒，与呼肠孤病毒不同，其外壳是单层的，并可显示出假性膜。 3．分离培养 本病毒可在鸡胚卵黄囊中生长繁殖，但必须在33.6℃中培养才能成功。 也能在鸡胚绒毛尿囊膜上生长，培养4～8天，引起鸡胚全身广泛出血。以鸡胚静脉注射培 养则更为敏感。本病毒可在羊胎肾、牛胎肾、乳鼠肾和乳仑鼠肾原代或传代细胞中生长。应鸡胚的毒株可在犊牛肾、牛睾丸单代细胞和Hela细胞及乳仑鼠肾原代细胞中生长，引起细胞病变。病毒在绵羊肾单层细胞培养，24～72h出现细胞病变，几天内感染全部细胞，使细胞脱落。在非洲绿猴细胞(Vero)中能形成空斑，抗蓝舌病血清可以抑制空斑形成。 4．动物试验 人工脑内接种吮乳小鼠或仑鼠，约5～7天发生致死性脑炎。脑内接种成 年小鼠不表现症状，但病毒可在成年小鼠脑内短期繁殖。将发热期病羊(或病牛)血液或 脾、淋巴结悬液，静脉或皮内接种易感羊和经蓝舌病疫苗免疫的绵羊各3～5只，观察3～10天，易感羊出现与自然病例相同的症状，而免疫羊不出现任何症状。 二、琼脂凝胶免疫扩散试验 (一)材料准备 1．抗原、标准阳性血清，均由指定单位供应，按说明书使用。 2．被检血清 应无溶血，无杂菌污染，保存于4℃，不超过三周。 3．器材 直径6cm平皿，微量移液器及微量滴头，三角烧瓶，4mm打孔器、观察灯、 水浴箱。 4．琼脂板的制作：取琼脂糖0.8～0.9g加入100ml生理盐水中，按1：10000比例加入叠氮钠或硫柳汞，调整pH为7.4～7.6，3.629kg高压灭菌10min，待冷至45～50℃时，倒人平皿中，每皿约7ml(厚度约为2.5mm)。凝固后置冰箱4℃保存备用。 (二)操作方法 1．琼脂板打孔 用打孔器在琼脂板上打孔，孔径4mm，孔距3mm，各孔排列如图14， 打孔后挑出孔内琼脂块。 2．加样 用微量移液器吸取被检血清滴加于周边孔，每隔l孔滴人1份。中心孔滴加 抗原，空下的周边孔内滴加标准阳性血清。每孔均以加满不溢出为度。 3. 反应 加样完毕，静止10min，放人20～22℃水浴箱中或放人湿盒置37℃温箱中反应，分别在24、48和72h观察并记录结果。 (三)结果判定 (1)判定方法 将琼脂板置暗背景或侧强光照射下观察。标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验可以成立。若没有沉淀线或不明显，则试验不能成立，应重做。 2．判定标准 (1)被检血清与抗原孔之间出现明显清晰白色沉淀线，并与标准阳性血清孔的沉淀线相接者，判为阳性，记作“+ ”，如图15一I所示。 (2)抗原与标准阳性血清孔之间的沉淀线端部向被检血清孔的内侧弯曲，而被检血清 孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，则为弱阳性。凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性反 应者，判为阳性，记作“+”，如图15一Ⅱ所示。 （3）被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，标准阳性血清：与抗原孔之间沉淀线直伸延到被检血清孔边缘无弯曲者，判为阴性，记作“一”，如图15一Ⅲ所示。 (4)抗原孔与被检血清孔之间沉淀线粗面混浊，或与标准阳性血清和抗原孔间的沉淀 线交叉并直伸被检血清孔边缘者，则为非特异反应应重试，若仍出现非特异反应则判为阴 性。如图15一Ⅳ所示。 复习题与作业 1．写出蓝舌病病原学检查的方法与步骤