家畜传染病学实验指导：钩端螺旋体病的实验室诊断.docVIP

实验十二．钩端螺旋体病的实验室诊断 目 的 1．初步掌握钩端螺旋体病的病原学检查技术。 2．初步掌握钩端螺旋体病凝集溶解反应的操作方法。 内容及方法 从有疑似急性钩端螺旋体病症状的动物的血液和乳中分离到钩端螺旋体是有诊断价值 的。但从血液中分离是有一定难度，因为菌血症和临床症状往往不是同时出现。如在动物 死后采集器官进行分离，能证明是全身性钩端螺旋体感染，则认为有诊断意义。从流产胎 儿或死产胎儿的体液或各脏器中证实有钩端螺旋体，也可被诊断为母畜慢性钩端螺旋体病， 而且也是胎儿活动性感染的见证，所以病原学检查是很灵敏的一种方法。 钩端螺旋体病的病原学检查 1．检查材料 (1)生前 血液(病畜发热期未出现黄疽前采取)和尿液(发病后6～10天后果取)。 (2)死亡 取肝、脾、肾及脑，应不迟于死后1～3h采取。 (3)流产或死产胎儿的体液或各脏器。 2．镜检 (1)直接镜检法 静脉采血3～5ml，加入1／10量的10％枸橼酸钠或10％草酸钠溶液混合；吸取中段尿5～10ml。上述两样本均用1500r／min离心5min，血液样本取上层血浆；尿取上清液，再以3000～4000r／min离心1～2h，然后取沉淀物制片在暗视野显微镜下检查。 肝、肾组织制成1：5或1：10悬液，经1500r／min离心5min，，取上清液涂片；或再以 3000r／min离心1h，取沉淀物制片在显微镜下检查。 在暗视野显微镜下，可见到形态如一长链，长约4—20μm，直径0.15～0. 2μm，在靠近其菌体的1／3处比较柔软，常弯曲成钩状的钩端螺旋体。其活动以菌体轴为中心，作回旋运动，或扭曲或以波浪式依菌体直端方向前进。 (2)染色镜检 姬姆萨染色法 涂片自然干燥，浸于盛有甲醇的玻缸中或滴加甲醇数滴于玻片上固定 3～5min，干后将玻片浸于盛有姬姆萨染液的染色缸中，染色半小时至数小时(过夜亦可)，水洗，吸干，镜检，钩端螺旋体呈红色或紫色。 方登纳氏镀银染色法： 染色液配制 固定液为冰醋酸lml、40％甲醛10ml及蒸馏水10ml混合。鞣酸媒势剂为鞣酸5g与蒸馏水100ml混合。染色液为硝酸银5g，蒸馏水100ml㈠陆用前取硝酸银液20ml，缓缓滴加10％氨液至所产生的褐色沉淀经摇动后恰能完全溶解为止，然后再滴加硝酸银溶液数滴，以溶液于摇匀后仍显轻度浑浊为度；经氨液处理的硝酸银溶液不耐保藏，每次染色应以新鲜配制的为佳。 染色法 标本制成薄层涂片，自然干燥；用固定液固定1~2min；加无水酒精数滴，洗去固定液(如涂片系由动物的组织材料制备的，还应再用乙醚洗涤以除去脂肪，再用酒精境除乙醚)；滴加鞣酸媒染剂，并加热使发生蒸汽，染30s；用水冲洗后，滴加经氨液处理的硝酸银溶液，加热使发生蒸汽，染30s；水洗、干燥，加盖玻片，用加拿大树胶固封，用油镜检查(如不加盖玻片镜检，可因香柏油而致螺旋体脱色)。 在油镜下检查时，可见底黄，菌黑，菌体与背景界限清晰，菌体形态绝大多数为两头尖的梭状形，有时菌形弯曲如蚯蚓。 3．分离培养 (1)培养基 柯托夫(Korthof)氏培养基 基础液制备： 蛋白胨 0.8g 氯化钠 1.4g 氯化钾 4ml 1%溶液 碳酸氢钠 2ml 1%溶液 碱性磷酸钠 0.96g 酸性磷酸钾 1.8g 氯化钙 4ml 1%溶液 上述成分置水浴中(100C)、30min使之充分溶化，用滤纸过滤，分装前校正pH7.3～7.4，分装后经101b30min灭菌，应完全透明，无沉淀物。如果碱性磷酸钠用12H2O，其用量应为1.76g。 健康兔血清 无菌采集健康兔血分离血清，在水浴中56～58℃灭能1—2h，4℃冰箱保存备用。 上述基础液在无菌条件下添加1／10量已灭活的健康兔血清，经无菌检验合格即可用于培养。 (2) 培养材料 无菌采取病畜血液，同时接种三管培养基，第一管加1滴，第二管加2滴，第三管加3滴。 无菌采集病畜新鲜中段尿接种于数管培养基内，以3000r／min离心30min，取沉淀物1～2ml进行培养。为防尿内污染杂菌，可在培养内加入0.05g磺胺嘧啶，也可用细菌滤器除杂菌。 用作培养的脏器(主要是肝、肾)。用吸管插入脏器内并向不同方向，从脏器不同部位吸取些粉碎的组织出来，并将取得材料接种2～3管培养基内，亦可以用无菌剪刀剪碎组织进行培养。 (3) 培养观察 接种病料的培养基置于28～30℃温箱内，每5天作一次悬滴压片在暗视野显微镜下观察其生长