应用双荧光报告系统检测斑马鱼microrna 的动态表达 - 遗传.pdf

HEREDITAS (Beijing) 2012 9 , 34(9): 1181―1192 ISSN 0253-9772 技术与方法 DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.01181 应用双荧光报告系统检测斑马鱼microRNA 的 动态表达 1 1 1 1 2 1 杨红波 , 梁巍 , 刘新星 , 朱作言 , 林硕 , 张博 1. , , 100871; 2. 美国加州大学洛杉矶分校, 分子、细胞与发育生物学系, 洛杉矶 90095-1606 microRNA(miRNA)是一类细胞内源表达的小分子非编码RNA, 主要通过降解靶基因的mRNA 或者抑制 靶基因的翻译, 在动植物的发育以及其他重要的生理过程中起调控作用。miRNA 的功能跟它的表达位置与时间 密切相关, 但是目前尚缺乏一个能够在活体与个体水平稳定、持续地实时观察 miRNA 动态表达的方法。文章 以斑马鱼为模式, 建立了一个双荧光报告系统(我们称之为miRNA Tracer), 用于在斑马鱼整体胚胎中追踪特定 miRNA 的表达谱及动态变化过程。该系统以Tol2 转座子为基础, 采用来自斑马鱼 hsp70 基因的热激启动子分 别驱动eGFP 和mRFP1 荧光报告基因, 同时在其中一个报告基因的3′-UTR 区连接待测miRNA 的互补序列, 构 成Tracer 质粒。该互补序列与斑马鱼胚胎中相应的内源miRNA 结合后能够使对应报告基因的荧光信号强度减 弱, 通过比较两个报告基因在表达谱上的差异辨别miRNA 的表达区域, 检测斑马鱼胚胎中miRNA 起作用的位 置和时间。文章选择在肌肉系统特异表达的 miR-206 以及在神经系统特异表达的miR-219, 分别在显微注射瞬 时表达和转基因稳定整合等两个层次上验证了上述Tracer 系统。结果表明, 所用的方法能够如实地在单细胞水 平和整体水平检测到目标miRNA 的时空表达动态变化。miRNA Tracer 系统为在斑马鱼发育过程中对miRNA 进行活体、实时的时空定位提供了一个独特而有效的方法, 也为对 miRNA 进行功能与作用机制等更深入的研 究奠定了基础。 斑马鱼; miRNA; 双荧光报告载体/Tracer; 热激启动子 Detection of dynamic expression of microRNAs in vivo using a dual-fluorescence reporter system/miRNA Tracer in zebrafish 1 1 1 1 2 1 YANG Hong-Bo , LIANG Wei , LIU Xin-Xing , ZHU Zuo-Yan , LIN Shuo , ZHANG Bo 1. Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education, College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China 2. Department of Molecular, Cell Developmental Biology, University of California, Los Angeles, Los Angeles , CA 90095-1606, USA 收稿日期: 2012−06−18; 修回日期: 2012−07−16 基金项目: (2012CB945101)(31110103904)