猪克隆胚胎激活方法优化与转人溶菌酶基因克隆猪的生产.pdf

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2013, 40(1): 72~79 克隆胚胎激活方法优化与转人 溶菌酶基因克隆猪的生产* 1, 2) 2, 3) 2) 2) 1) 卫恒习 李 俊 童 佳 马育芳 高凤磊 2) 1) 2)** 李秋艳 张守全 李 宁 (1) 广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，华南农业大学动物科学学院，广州5 10642 ； 2) 农业生物技术国家重点实验室，中国农业大学生物学院，北京100 193； 3) 河北医科大学第一医院生殖医学中心，石家庄05003 1) 摘要 为了提高转基因克隆效率和获得转人溶菌酶基因克隆猪，研究了不同电激活参数和化学辅助激活方法对猪克隆胚胎和 孤雌胚胎体外发育的影响 结果发现：电场强度会显 影响克隆胚胎的融合率和体外发育能力(P 0.05)，电脉冲次数对克隆 胚胎体外发育促进作用不显 (P 0.05)，而相同电激活条件下克隆胚胎和孤雌胚胎的体外发育能力变化趋势不同；电激活后 再利用放线菌酮 细胞松弛素B(CHX CB)处理4 h 能显 提高克隆胚胎的囊胚率( 0.05)，而用二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处 + + P 理没有提高克隆胚胎囊胚率(P 0.05)，但6-DMAP 或CHX+CB 处理均可显 提高孤雌胚胎的囊胚率(P 0.05) 上述结果表 明，最佳的孤雌激活条件并不一定是克隆胚胎的最佳激活条件 本研究中猪克隆胚胎的最佳激活方法为 1.6 kV/cm、100 s、 2 次直流电脉冲间隔 100 s，再辅以CHX+CB 处理4 h 利用优化的激活条件成功获得了乳腺特异表达人溶菌酶的转基因 猪，为猪转基因育种奠定了基础 关键词 体细胞克隆，胚胎激活，转基因，人溶菌酶，猪 学科分类号 Q819，S828.9 DOI: 10.3724/SP.J.1206.20 12.00082 在当前养猪业，致 菌的感染会严重影响到仔 在畜 业和科学研究中的应用 猪体细胞克隆技术 猪的生长和成活，且容易产生抗药性，是全世界范 是一项复杂的技术体系，受到供体细胞、受体胞 围内亟待解决的重要问题之一 溶菌酶是一种天然 质、融合与激活、胚胎培养、胚胎移植和显微操作 [12] 的 谱抗菌素，对细菌、真菌和病毒都具有很好的 等多个技术环节的影响 ，其中融合与激活是克隆 抑制作用，已经 泛应用于食品和医药等领域[1] 胚胎制备和启动发育的关键因素，在很大程度上决 有研究报道，给仔猪饲喂表达人溶菌酶(human 定着克隆胚胎的发育能力 当卵母细胞的核被体细 lysozyme ，hLY) 的转基因羊奶，可改善断奶仔猪的 胞核置换以后，必须进行激活才能够使胚胎启动发 胃肠道功能，抵抗致病性大肠埃希菌(EPEC) 的感 育 关于猪克隆胚胎激活的报道较多，最常用的方 [2-3] [14] 染，且不会引起炎性反应 人乳中溶菌酶的含 法是电激活 为了提高激活效果，一些化学药物 量和杀菌活性远远高于牛和猪[1, 4] 因此，如果在