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生生命命奥奥秘秘wwwwww..lliiffeeoommiiccss..ccoomm 白在细菌中干扰GFP的正确折叠。经过四轮DNA重 为649 nm ，比原来位移了37 nm ，并且这种荧光蛋 排，研究人员分离得到包含六个新的突变的荧光亮 白也表现出非常大的斯托克司频移，达到59 nm 。 度强的克隆。这一工作至关重要的一点就是：即使 早期得到的克隆mRaspberry发射谱波长更短，为 在高度优化的GFP变体中也还有很大的工程改进空 625nm 。虽然mRaspberry 的光稳定性不足以在活 间。将这种方法应用在其它颜色的蛋白中可能会得 细胞成像中应用，但mPlum的光稳定性与黄色光谱 到相似的结果。 型的许多蛋白相当。 钱永健等发明了一种真正独特的方法进行基因 采用以上描述的方法对已有的蛋白进行微调， 工程改造荧光蛋白，包括采用从免疫系统借鉴来的 来改进它们的折叠特性、亮度、齐聚效应及光稳定 技术迭代体细胞超突变 （somatic hypermutation, 性，毫无疑问最终能够得到比简单地从海洋中寻找 S HM ）来直接优化。他们要产生发射波长在远红 到的荧光蛋白更好的探针。最近，荧光蛋白工程技 外区 （625nm ）的红色荧光蛋白变体。人们已经 术的突破已经得到了几种新的变体，这些都是传统 知道，B淋巴细胞能够通过SHM将点突变引入抗体 方法无法做到的。这些技术已经用来产生新的颜色 的可变区。研究人员证实，能够在超突变表达免疫 的荧光蛋白、建立更稳定的结构、增强折叠效率及 球蛋白的B细胞系Ramos 中采用这一技术来产生新 优化FRET效率。或许新的方法将能够使得pH敏感 的荧光蛋白。在Ramos细胞系中表达mRFP1的一 性及光稳定性得到改善，这两点对其在酸性的细胞 种变体，启动子为四环素诱导启动子，载体为逆转 器官及长期成像实验中的应用是至关重要的。已知 录病毒，其转录在强力霉素调控下来控制S HM 的 许多氨基酸三联体能使发射颜色发生巨大变化 （如 水平。用FA CS富集来选择最长发射波长的克隆， MY G ，177 nm ；QY G ，137 nm ；TY G ，9 1nm ； 此过程需要多次重复。23轮后分离得到一种单体， CY G ，80nm ），这表明在荧光蛋白序列中有足够 发射波长在远红外区，并命名为mPlum （表6 ）， 的空间添加额外的突变，从而能够优化颜色及多种 同时对它的特性加以鉴定。mPlum 的最大发射谱 其它荧光蛋白的性质。 参考文献 1. Nathan C. Shaner, George H. Patterson Michael W. Davidson. (2007) Advances in fluorescent protein technology, Journal of Cell Science, 120: 4247-4260. 四、 更多阅读 1.GFP的科学影响 随着GFP类蛋白作为细胞内遗传标签的应用以及成像技术、数据分析的快速发展，GFP在生物科学中的 应用得到极大的推进。早期发展起来的生物物理荧光方法，如FRET 、荧光相关谱 （fluorescence correlation spectroscopy, FCS ）、荧光交叉相关光谱 （fluorescence cross-correlation spectroscopy, FCCS ）、光 脱色荧光恢复技术 （fluorescence recovery after photo-bleaching, FRA P ）和全内反射显微术等，都是借 助G FP类蛋白发出的荧光信号来监测细胞内发生