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实验4 酶联免疫吸附试验 （ELISA） Principle : antigen + antibody Two necessary conditions: specificity visibility 材料与器材 小鼠IgG，抗小鼠IgG 抗小鼠IgGFc-HRP（辣根过氧化物酶） 包被液（pH8.9、0.01M Tris-HCL） pH7.2、0.01M PBS 抗体稀释液（含1%小牛血清的PBS） 封闭液（含20%小牛血清的PBS） 洗涤液（含1%小牛血清和0.05%吐温的PBS） 四甲基联苯胺 (TMB) 2N硫酸液 酶标测定仪及酶标测定板 吸管、吸球及吸水纸、微量加样器等 7. 结果判断 定性测定： （1）目测：白色背景下肉眼观察 （2）酶标仪测定：于波长450nm、490nm处检测OD值 定量测定： 用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下绘制标准曲线，通过各孔的OD值在标准曲线上相应位置计算出相应浓度 注意事项 包被抗体(或抗原)的选择 纯度要好 样品 体液、分泌物、排泄物； 新鲜采集和检测，避免溶血； 不能及时检测的标本宜分装低温保存，切忌反复冻融 通过查文献或预实验大概确定标本中样品含量，再对样品进行稀释，加样 酶的底物及供氢体的选择： 价廉、安全、有明显的显色反应，而本身无色； 底物使用液必须新鲜配制 洗涤！！！ 分离游离的和结合的酶标记物 思考题 在酶联免疫分析中，要获取准确的检测结果应注意哪些事项？ /experiment/430/502/519/520/21258.htm /experiment/430/502/519/520/32164.htm 28/151/re1/mei/html/jbzs/BAS/right_4_2_1.htm#（生物素—亲和素系统） 实验结束，请清理桌面和地面！ * * 实验目的 掌握酶联免疫吸附试验的原理及其用途 熟悉双抗体夹心法和间接法的操作步骤 Ag-Ab complex Antibody as research and diagnostic tools 实验原理 免疫标记技术 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶技术：HRP，AP ELISA： Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 实验原理 用酶标记抗体（或酶标记抗抗体）进行抗原抗体反应，从而将抗原、抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断实验结果; 可经酶标测定仪作定量分析，灵敏度可达微微克（pg）水平 特异性强，灵敏度高，定性定量检测 常用于标记的酶： 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP） 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）; 它们与抗体结合不影响抗体活性，有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间 实验原理 基本方法： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 双抗体夹心法： 已知抗体吸附固相载体，检测未知抗原 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等； 只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。 1st Ab Ag 2nd Ab substrates Colored products Enzyme 双抗体夹心法： 已知抗体吸附固相载体，检测未知抗原 固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关 间接法：已知抗原吸附固相载体，检测未知抗体 ——利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体 ——可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 显色 间接法：已知抗原吸附固相载体，检测未知抗体 ——利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体 ——可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 免疫吸附剂 结合物 酶的底物 操作步骤：双抗体夹心法 1.包被：抗原或抗体固定在固相载体的过程 取羊抗鼠IgG包被单抗,用0.01MTris-HCl稀释（1~10μg/ml）,加入96孔板中,每孔100μl,4℃过夜或37℃,2h； 2.封闭：高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程(封闭酶联板上未结合抗体(抗原)的微孔)