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2013-01-15 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：青枯雷尔氏菌胞外蛋白电泳分析(二） 试验人员：代升飞 试验负责：郑雪芳 报告日期：2013-01-15 计数月份：2013年月 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 05911．试验目的 Ralstonia solanacearum拥有的Ⅲ型分泌系统能分泌一类被宿主细胞中相应的抗性蛋白识别，并通过这种识别诱发宿主产生过敏反应，在细菌与宿主的的接触位点发生细胞程序性死亡，从而抑制细菌的侵染，因此这在不能引起宿主细胞感病的无毒因子被称作非致病性效应蛋白。茄科青枯雷尔我菌Ⅲ型分泌系统分泌的74种效应蛋白中存在与Pseudomonas syringe 和Xanthomonas campestris等细菌同源的非致病性效应蛋白，如AvrPtoB、AvrBs、AvrPphE等，其中AvrPtoB、AvrBs在番茄等植物均鉴定出相应的抗性蛋白，而AvrPphE等可能参与细菌对宿主的特异性选择。AvrA是一类已被证实的茄科青枯雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统分泌的非致病性效应蛋白，能够诱导烟草植株产生过敏反应从而抵御AW1和GMI1000株系的侵染，但AvrA并不昌决定烟草植株对AW1株系产生过敏反应的唯一因子，PopP1也参与诱导宿主产生过敏反应。 本试验通过青枯雷尔氏菌蛋白，致病性青枯雷尔氏菌在差异。 2．试验方法 2.1试验材料 2.1.1菌株：试验菌株及来源见表1。 表1 菌株以及来源 菌株编号 来源 物种 致病性强弱自己分离 自己分离 76 自己分离 自己分离 番茄 91 自己分离 番茄 1422 自己分离 番茄 2.1.2 试剂与仪器 （1）试剂 蔗糖蛋白胨KH2PO4 ，MgSO4 ，乙醇，甲醛，乙酸，Na2S2O3·5H2O，Na2CO3，EDTA。 （2）仪器 THZ-D台式恒温振荡器；Gel Doc-ItTM UVP凝胶成像系统；BIO-RAD PowerPacTM Basic电泳仪。 2.2 试验方法 TTC培养基：10g蛋白胨，1g水解酪蛋白，5g葡萄糖，17g琼脂，1000mL蒸馏水，pH值调节到约7.4左右，分装，121℃灭菌20min。灭菌后当冷却至55℃左右加入已灭菌的1%的TTC（2，3，5–氯化三苯基四氮唑）水溶液其终浓度为0.005%，最终pH值为7.2左右。 SPA培养基：5g蛋白胨，20g蔗糖，0.5g KH2PO4，0.25g MgSO4，1000mL蒸馏水，pH值调节 到约7.4左右，分装，121℃灭菌20min，最终pH值为7.2左右2.2.2不同致病性青枯雷尔氏菌以无菌操作挑取1环不同致病性青枯雷尔氏菌分别接入20ml SPA培养液中，于30 ℃下170 r/min振荡培养 h。 2.2.不同致病性青枯雷尔氏菌摇瓶培养至48 h后停止发酵，各取少量的上述发酵液，10000rpm离心15min，收集上清液，备用。 灌制凝胶：参照《分子克隆实验指南》进行，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。 点样及电泳：分别取0ul的上述各菌株发酵液原液、上清液，与等量样品缓冲液混合，沸水浴3min，用50ul微量进样器将已准备好的样品加入到样品槽内（每个样品加0ul），并加标准蛋白质分子量标准。电泳时电压先设定在0v，待样品进入分离胶后再调至10v。 染色：h后，指示剂已跑至距凝胶底部约1cm处，停止电泳。取出凝胶，水洗3次，5min/次2.固定：固定液（25ml乙酸，100ml乙醇，加水至250ml）摇浸2h3.敏华：敏化液（0.5g硫代硫酸钠，17g乙酸钠，75ml乙醇，加水至250ml）摇浸30min4.漂洗：250ml双蒸水洗3次，5min/次5.银染：AgNO3溶液（1.25g/500ml水）中摇浸20min（报纸避光）6.漂洗：250ml双蒸水洗2次，1min/次7.显色：显色液（12.5g碳酸钠，200微升甲醛，加水至500ml）显色约2-5min，2次8.终止：终止液（3.65gEDTA溶于250ml水）摇浸10min9.漂洗：500ml双蒸水洗2次，10min/次 试验结果 3. 不同致病性青枯雷尔氏菌利用法对不同青枯雷尔氏菌蛋白质电泳分析见 图1 不同致病性青枯雷尔氏菌上清液蛋白质电泳（银染法） 试验讨论 利用法对青枯雷尔氏菌 5．参考文献 [1] Hayward, A.C