重组人胰岛素类似物desb 的结构及生物效价分析.pdf

中国医药生物技术 2013 年 2 月第 8 卷第 1 期 Chin Med Biotechnol, February 2013, Vol. 8, No. 1 19 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.01.005 ·论著· 重组人胰岛素类似物 DesB30 的结构 及生物效价分析 蒋利敏，陈勇，李红亮，万颖，曹宇，何跃，范开 【摘要】 胞法分析其生物效价。 目的 确认重组人胰岛素类似物 DesB30 的结构，分析其生 物效价。 1 材料与方法 方法 在毕赤酵母中构建表达含有短 C 肽 AAK 并去掉 1.1 材料 30 B 链第 30 位氨基酸（T ）的人胰岛素原类似物 HMPIDesB30 ， 1.1.1 试剂 DesB 和脂肪细胞由重庆富进生物 经胰蛋白酶酶切纯化获得 DesB30 。利用 N 末端氨基酸序 医药有限公司提供；胰岛素国家标准品（批号 列测定，质量肽谱分析，圆二色谱等方法进行结构确认及质 140633-201104，28.3 IU/mg ）购自中国药品生物制 量分析。利用 RP-HPLC 法，小鼠血糖法，脂肪细胞法分 品检定所；V8 酶购自美国 Sigma 公司；D-[3-3H]- 析其生物效价。 葡萄糖购自 Amershan 公司。 结果 DesB30 的 N 端氨基酸序列、二硫键配对、圆二色 1.1.2 仪器 Welch Materials Ultimate®XB-C18 色 谱值与理论值一致，其生物效价与人胰岛素基本一致。 谱柱（4.6 mm × 250 mm ，5 μm ，300 μm ）购自美 30 国 Welch 公司；Aglient 1100 型 HPLC/MS 购自 结论 毕赤酵母分泌表达的胰岛素类似物 DesB 结构正 安捷伦公司。 确，胰岛素去掉 B 链第 30 位的苏氨酸，不影响其生物 1.1.3 动物实验 SPF 级 KM 小鼠，雄性，初始 活性。 体重 18 ~ 22 g ，购自重庆医科大学。 【关键词】 毕赤酵母； 胰岛素类似物； 生物效价 1.2 方法 中国医药生物技术, 2013, 8(1):19-23 1.2.1 N 末端氨基酸序列测定 委托中科院上海 生命科学院蛋白质组学研究分析中心采用 Edman 胰岛素是人体内唯一可降低血糖的激素，对于 降解法进行 N 端 15 个氨基酸序列测定。由于 糖尿病的治疗特别是抑制并发症至关重要。目前国 30 DesB 系 A 、B 两条链通过二硫键连接，因此在 际上生产医用重组人胰岛素的主要方法是通过基 对其进行 N 端氨基酸测序时会产生两条肽段，其 因工程大肠杆菌或酵母菌发酵生产人胰岛素前体， 中 A