利用cesi-ms技术完成高通量生物药物定性分析 - 仪器信息网.doc

如何利用CESI-MS技术完成高通量生物药物定性分析 介绍 ? ? ? 单克隆抗体（MAbs）是主要的生物治疗药物之一，目前已有30种单抗用于治疗癌症、自身免疫性疾病和全身性感染，不仅如此，还有一些抗体仍在研发中1。与小分子药物不同，单抗是平均分子量高达150 kDa的蛋白质，并且由于糖基化和降解修饰的原因，使得单抗具有高度异质性。为了将成本和细胞毒性降到最低，除了原研的单抗之外，人们还在不断开发诸如抗体偶联药物、生物类似药、biobetters、新一代抗体等替代药物2。因此，不仅在开发和生产阶段表征分析原研单抗非常重要，还需要监测新替代药物中任何可能影响其治疗性、生物有效性和安全性的氨基酸序列变异和/或糖基化模式变化。 ? ? ? 由于质谱能够快速、高效、全面地分析高度复杂的糖蛋白，目前已有一系列基于质谱的方法应用在单抗的表征分析中。其中大多数方法在质谱前端采用液相色谱作为分离手段。但是这些方法需要在液相分析前，先从多肽链中分离出糖基化部分。这个去糖基化步骤需要切除在反向液相色谱中导致糖肽在死体积洗脱出来的亲水性的糖基。另一方面， 如果采用HILIC等固定相来分析糖或糖肽，则将会影响非糖基化肽段的鉴定。因此，需要在不增加额外步骤的情况下，一次进样即可实现高极性糖肽和未修饰肽段分离和分析的新技术。 ? ? ??毛细管电泳（CE）是基于在高电场下溶质在窄孔毛细管中的不同迁移速率而实现。最常用的CE是以带电粒子的电泳迁移率差异为基础的毛细管区带电泳（CZE）。 ? ? ? 此外，电渗流（在外加电场下，毛细管内的流体运动）的存在推动CZE模式下的液体总体流动。尽管CE作为常规分离手段已经超过二十年，但仅在上世纪80年代后期才通过鞘液连接方式实现CE和ESI-MS的联用3。但该连接技术的问题在于鞘液会稀释CE分离出来的组分浓度 ? ? ??目前实现超低流速CE和质谱联机的最新方法是将CE和ESI动态整合在同一个装置上，组成CESI-MS。首先去除毛细管出口处的聚酰亚胺涂层，并蚀刻出多孔尖端。然后将该CESI尖端插入ESI喷雾针中，并且在其中加入导电液体以形成电流通路（图1）。采用全新的CESI多孔尖端的喷针设计，化合物能通过电泳迁移率进行分离，在ESI条件下离子化并通过质谱检测器检测其质荷比。将CE和ESI整合在同一装置上即保留了ESI的优势，又延续了CE窄峰宽、高分辨、高分析速度的特点。 图1. CESI设计示意图 ? ? ? 然而，由于快速的CE分离大大缩短了分析时间，为了保持分离效率，搭配高扫描速度的全新TripleTOF?5600+质谱系统成为了理想的选择。TripleTOF?系统能够在高扫描速度下同时获得高分辨和高质量精度的MS及MS/MS信息。 ? ? ? 本次试验中，采用CESI 8000-TripleTOF?系统定性分析生物药物曲妥珠单抗。曲妥珠单抗是在中国仓鼠细胞系中产生的人源化重组抗体，其靶标为乳腺癌中过量表达的HER2/neu受体。该抗体由2条轻链和2条重链组成，并在Asn300上存在N-糖基化。曲妥珠单抗是典型的IgG1型单抗，因此本文利用曲妥珠单抗胰酶酶切后的溶液考察CESI 8000-TripleTOF?在生物药物肽段和糖肽分析的能力。由于CE的分离优势，因此无需将糖肽和未修饰肽段预先分离，一次运行即可完成分析。 实验设计 ? ? ? 样品制备：使用Rapigest溶解100 μg曲妥珠单抗，再分别用二硫苏糖醇和碘乙酰胺完成还原和烷基化。样品在37 ℃下过夜胰酶酶切，干燥后复溶于100 μL前导电解液（100 mM乙酸铵，pH4）中。酶切后抗体的最终浓度为1 μg? / μL。 ? ? ? CESI-MS：CE分离采用的是CESI 8000高效分离系统，质谱为TripleTOF 5600+。进样量仅为50 nL（相当于100 fmol酶切后抗体）。将溶解到100 mM浓度前导电解液中的样品引入未涂层熔融石英毛细管并采用瞬时等速电泳（t-ITP）对样品进行在线浓缩。背景电解液为10%乙酸，在入口和CESI喷雾口间施加20 kV电压。化合物在分离毛细管中通过电荷与其流体动力学体积比迁移并实现分离，在喷雾口处按照ESI机理实现离子化并进入质谱中。 ? ? ??信息依赖性扫描（IDA），高分辨TOF MS作为预扫描，同时触发若干个MS/MS扫描。IDA参数：TOF MS预扫描时间为250 ms；对响应超过150 cps的最强30个离子进行MS/MS扫描，扫描时间50 ms；工作软件根据不同的质荷比自动选择相应碰撞能量；动态排除时间设为5 s。一次IDA工作周期为1.8 s。为了更好的匹配高速CE分离，对IDA参数事先进行了优化。在分析中，每三个分析进行一次自动校正功能，以保证仪器优异的精确度。 ? ? ? 数据分析