增强型绿色荧光蛋白基因的克隆和表达.doc

发绿光的细菌获得实验设计 小组成员：樊鑫2013141241103 李晓丽2013141241148 注：周五单周实验 前言: 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。 EGFP（Enhanced GFP)即增强型绿色荧光蛋白，它的27k Da的单体由238个氨基酸构成，本身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基。其发光过程不同于其它生物发光组织，是不需荧光素酶参与的。在紫外光激发下可发绿色荧光，常用作信号蛋白或报告基因。 载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去外源基因进入受体进行繁殖和表达，需要运载工具，携带细胞的这种工具就叫载体。pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码了EGFP蛋白，是野生型绿色荧光蛋白（wtGFP）经技术改造而成的遗传突变体。pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。 目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。 本实验将目的基因与EGFP基因插入载体重组表达，形成融合蛋白，在细菌中表达，通过荧光显微镜、共聚焦显微镜或紫外灯观察，可直接在活细胞中检测其荧光信号，简易方便地定性检测目的基因的表达，以及进一步研究目的蛋白的定位与动态过程。 1、总实验流程 ⑴ 准备实验所需试剂和器材 ⑵ pEGFP-N3和pET-28a质粒的提取与检测（实验一） ⑶ pEGFP-N3和pET-28a质粒双酶切及连接反应（配制 LB固体培养基平板（含Kana抗生素40μg/ml）,每个人5个平板）（实验二） ⑷ pET-28a-GFP重组质粒转入DH5α扩增，菌落PCR鉴定阳性克隆（实验三） ⑸ 提取重组质粒转入BL21中诱导表达绿色荧光蛋白（实验四） 2、试剂配制量 LB培养液（100ml），五瓶 (胰蛋白胨)：10g/L Yeast Extract(酵母提取物)：5g/L NaCl(氯化钠)：10g?/L???? 若配置固体培养基，则再加入15g Agar(琼脂粉)。 质粒提取溶液I , II , III，各100ml 溶液I：50 mM葡萄糖 、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II：0.2 M NaOH、1% SDS； 溶液III ：3 M 醋酸钾 、 2 M 醋酸 1xTAE电泳缓冲液（1L） 称量Tris 4.84g于1L烧杯中；向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 加入0.5M EDTA 2ml ,冰乙酸1.142ml，充分溶解； 加去离子水定容至1L后，室温保存。 3、具体实验过程 3.1 质粒DNA的提取及检测 一、实验目的 1 学习碱裂解法提取质粒的原理和方法。 2 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 二、实验原理 分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌、 分离和纯化质粒DNA 溶液 Ⅰ ： 50mmol/L 葡萄糖， 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防 10mmol/ L EDTA-Na， 止DNA的降解 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液 Ⅱ ： 0.4mol/L NaOH ， 作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时， 2%SDS 蛋白质与染色体DNA发生变性 临用前1：1配制。 溶液 Ⅲ ： 5mol/L 醋酸钾 60ml 作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清 冰醋酸 11.5ml 液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发 双蒸水 28.5ml 生沉淀 三、实验用品 1、仪器 恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL微量移液器各一支，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器。 2、材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液、1.5ml塑料离心管、EP管架、微量取液器和取液器吸头、常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等） 3、试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone