尿酸酶活性测定方法.docVIP

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2017-09-02 发布于天津
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尿酸酶活性测定方法.doc

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尿酸酶活性测定方法

实验方法蛋白质含量测定蛋白含量测定采用考马斯亮蓝检测法(Bradford检测法)和A280光吸收法，具体操作按文献[13]进行。尿酸酶活性测定方法主要试剂[14] 硼酸缓冲液储备液20 mmol/L EDTA，0.02% Triton-X100，pH8.5 1 mol/L硼酸缓冲液称取硼酸6.185 g，硼砂9.535 g，EDTA 1.169 g，10％ Triton X100 400 μL，ddH2O定容到200 m。尿酸稀释液1 mmol/L EDTA，0.001% Triton X100，pH8.5 50 mmol/L硼酸缓冲液取硼酸缓冲液储备液8 m加入ddH2O 152 m，检测pH=8.5。尿酸酶工作溶液储备液0.01% 尿酸，1 mmol/L EDTA，0.001% Triton X100，pH8.5 50 mmol/L硼酸缓冲液，用棕色瓶冷冻保存准确称取10 mg尿酸溶解于稀释液中，并准确定容至100 mL，此溶液作为储备液保准于4℃，测定活性时用相同缓冲液稀释10倍使用。尿酸酶酶活测定工作液0.001%尿酸，1 mmol/L EDTA，0.001% Triton X100，pH8.5 50 mmol/L硼酸缓冲液，用棕色瓶冷冻保存将尿酸酶工作溶液储备液稀释10倍在下每分钟催化1 μmol 尿酸所需的酶量为1个酶活力单位酶活力U/mg)=(U/mL)×1/C Vt：总体积()，Vs：样品体积()，：测试条件下的系数， 1.0：光径cm)，df：稀释倍数，C：酶浓度。将尿酸酶工作液储备液用pH8.5 50 mmol/L硼酸缓冲液稀释至尿酸浓度为0.6 mmol/L，按表加入0.6 mmol/L尿酸溶液、pH8.5 50 mmol/L硼酸缓冲液，每组测定样分别作3个平行测试对照。Table 1.1: Standard curve of uric acid 编号 0.06 mmol/L尿酸μL) pH8.5 50 mmol/L硼酸缓冲液μL) 尿酸终浓度mmol/L) 0 0 200 0 1 40 160 0.012 2 60 140 0.018 3 80 120 0.024 4 100 100 0.030 5 120 80 0.036 6 140 60 0.042 7 160 40 0.048 8 180 20 0.054 9 200 0 0.060 各管摇匀后静置约1 min，以不加尿酸的空白管(管号0)调零，用分光光度计测定29nm处的光吸收值。以尿酸浓度对29nm处的光吸收值作图，得到尿酸浓度标准曲线图.1)。酶活力U/mL)= (ODblank－ODtest) ×Vt×df 12.04×1.0×Vs×t 图1.1 尿酸浓度标准曲线 Fig 1.1 Standard curve of uric acid