实验二、利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性.pptVIP

实验步骤 1. 菌种的活化及酶的诱导表达 菌种活化：挑 pET28a-svixyn/BL21(DE3)单菌落于、 5ml LB+Km液体培养基37℃培养18h。 酶的诱导表达：1%的接种量转接于20mlLB+Km液体培养基于37℃培养至OD600=0.5-0.6，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，于30℃摇床振荡培养2-6h，以 空载体为对照。 2. 融合蛋白的可溶性分析： (1). 12000rpm 离心收集菌体，溶于无菌水中； (2). 超声破碎菌体：功率 200W，4sec，破碎90次，至菌液澄清； (3). 12000rpm离心5min收集上清； (4). 将沉淀悬于无菌水中； (5). 分别取上清、沉淀做样品处理及SDS分析。 3. 样品处理：向样品中加入等体积的SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冷却后上样或-20℃保存。 制胶：事先装好电泳板，配分离胶后立即用注射器灌胶，加少量水覆盖胶平面，聚合30min；倒掉或用吸水纸吸干水后，灌浓缩胶，插上梳子，聚合30min。 点样：小心将梳子拔掉；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板，加样20-40μl。注：一定要记住点样顺序 电泳：稳压，浓缩胶电压 60V，电流约为10-15mA；分离胶电压150V，电流约25-30mA，电泳3-4小时，至指示剂溴酚蓝到达底部。 染(脱)色：考马斯亮蓝R-250染色约1h，后沸水脱色约15min，知道蓝色退去。 实验结果 1.电泳结果图片 2.说明你认为整个实验过程中有哪些注意事项 * * 现代微生物学实验技术 谢响明 教授 北京林业大学 生物科学与技术学院 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 实验目的 1. 了解利用基因工程技术在大肠杆菌中表达外源蛋白 的原理； 2. 掌握SDS的原理、实验操作过程及重要性。 实验原理 基因的基本结构 基 因 转录区 启动子 ATG 终止子 TGA ORF：Opening Reading Frame RNA起始点 核糖体结合位点 实验原理 影响基因表达的因素： 启动子： 控制基因表达的第一步，是高表达的关键； 结构基因：密码子稀有性； 表达载体的拷贝数：商业化，pET系列、pGEX系列等。 实验原理 目的基因： 受噬菌体T7强转录、 翻译及终止信号控制； Lac操纵子； T7 RNA聚合酶启动； IPTG诱导； 有His-tagg标签； 大肠杆菌BL21 切 接 增 转 筛 表达 实验材料 1. 菌株：pET28a-svixyn/BL21(DE3) 2. 培养基及试剂 (1). 培养基： LB液体培养基 (2). 电泳溶液 A. 凝胶贮存液： 丙烯酰胺 29g；甲叉丙烯酰胺 1g，加水至100ml，置于棕色瓶中， 4℃存放。 B. 8×浓缩胶缓冲液：1mol/L Tris-HCl,pH6.8, 4℃存放。 C. 4×分离胶缓冲液： 1.5mol/L Tis-HCl,pH8.8, 4℃存放。 D. Tris-甘氨酸电泳缓冲液： Tris 3.03g, 甘氨酸 14.4g，SDS 1.0g，pH 8.3，4℃存放。 E. 上样缓冲液： 50 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8), 100 mmol/L 巯基乙醇， 2%(m/v) SDS, 0.1% 溴酚蓝，10% (v/v)甘油。 F. 10% SDS G. 10% 过硫酸铵 H. TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺) 3. 仪器设备： 垂直板电泳槽，电泳仪、超声破碎仪、移液器、摇床等 4. 电泳 制胶 点样 电泳 染(脱)色 表 分离胶与浓缩胶的配制 12%分离胶 5%浓缩胶 水 40%凝胶储液(ml) 分离胶缓冲液(ml) 浓缩胶缓冲液(ml) 10% SDS (ml) 10% 过硫酸铵 (ml) TEMED (ml) 总体积 (ml) 6.394 44.55 3.8 — 0.15 0.15 0.006 15 3.64 0.625 — 0.63 0.05 0.05 0.005 5 注意：灌胶前加过硫酸铵和TEMED * *