一株紫杉醇内生真菌的分离和鉴定.docx

实验：一株紫杉醇内生真菌的分离与鉴定不同的表面消毒方法和不同的培养基使得红豆杉内分离出来的内生真菌有其多样性，另外，由于红豆杉品种的不同，也可能使得实验结果出现一定的差异性．以下结合了中国红豆杉、南方红豆杉以及三尖杉的处理方法，来探讨从红豆杉内分离纯化内生真菌的方案，从而应用于实验室具体操作和取得最佳结果．如：采用化学法进行表面灭菌处理,运用平板涂布法及平板划线法得到内生真菌，然后利用分子鉴定法来鉴定菌种。材料及试剂１.１材料：百年红豆杉的树皮样品，某年某月采于_______１.２试剂：无菌水，蒸馏水，７５％乙醇溶液，０.１％升汞溶液,马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15-20g,蒸馏水100ml,lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液0.1g/l氯霉素或土霉素，0.05%吕氏碱性美蓝染色液,乙酸乙酯-丙酮，二甲醇，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，浓硫酸，香草醛，紫杉醇标准品,１.３仪器设备：无菌容器，培养皿，高温蒸汽灭菌锅，无菌剪刀或手术刀，无菌滤纸，细毛刷，恒温箱，电子分析天平，玻璃棒，纱布，试管或者锥形瓶，pH试纸，恒温箱，研钵，移液管，平板，接种环，超净台，酒精灯，胶头滴管，盖玻片，载玻片，镊子，光学显微镜，三角瓶，抽滤器，蒸发皿，分液漏斗，UF254硅胶板，电热鼓风干燥箱，喷壶，铅笔，直尺，毛细管，薄层板，层析缸，电吹风，酒精灯，镊子，紫外光灯，磨砂纸二．实验操作２.１内生真菌的分离２.１.1方法一：将树皮在洗衣溶液中浸泡３０min,并用细毛刷刷去表面污垢，然后在自然水中冲洗２０min.冲洗完成后转移至超净工作台上，用无菌滤纸吸干，放入７５％的乙醇中消毒３０s,然后用无菌水漂洗３次，再放入０.１％的升汞溶液中浸泡8min，取出后用无菌水漂洗４次．最后，用手术刀将树皮剪成０.５＊０.５cm小块，再放入事先准备好的PDA固体培养基平板中，２８℃恒温培养３－５d．每天观察一次，确定菌丝生长时间．等长出菌丝后，挑取平板中单一菌落进一步纯化，纯化后的菌株转接到装有PDA斜面培养基上，２８℃下恒温保存．当菌落长满斜面后，划线接种于平板培养基上，每２d观察一次，根据菌落的形状颜色以及长出时间的不同，有不纯的菌落就要继续划线分离培养，直到得到纯种．将纯化后的菌株编号记下，接入PDA斜面培养基，于２８℃恒温培养６－７d后，保存于４℃冰箱。((①无菌水使用量：前后共使用无菌水９次，大概需要？？ml无菌水；②乙醇制备：将100ml95%的酒精加蒸馏水至126ml后摇匀，即成75%的酒精，根椐C1V1=C2V2；③无菌水与蒸馏水：一般用实验室中的蒸馏水通过高温蒸汽法来灭菌即可得无菌水，无菌水水中的无机盐等一般来说不会减少．其温度指标和压力指标是？④升汞溶液制备：千分之一汞，1mL汞，汞的密度是13.6g/mL,用分析天平称取13.6g汞.⑤表面消毒检验：在材料是确定的情况下，肯定不会出现结果的“实验组”，我们称之为阴性对照，我们可以取最后一次无菌水冲洗液１００ul涂布到分离培养基下２８℃下培养１０d，观察消毒结果．注：如果未进行表面消毒检验，没有作阴性对照实验组，在出现结果时，我们要注意以平板划线法来排除其它杂菌污染；此方法为平板划线法的具体操作，涂布平板法有所不同．)(此过程所需试剂：无菌水，蒸馏水，７５％乙醇溶液，０.１％升汞溶液；此过程所需仪器：无菌容器，培养皿，高温蒸汽灭菌锅，细毛刷，手术刀，无菌滤纸，恒温箱)2.1.2方法二：组织研磨法，表面消毒方法同组织分离法，后将组织剪碎，置于研钵中充分研磨。以1: 10的比例加入无菌水，制备匀浆液，吸取100uL加入到分离平板中涂布。待菌丝长出后，挑取单菌落接种于PDA固体培养基中。纯化结束后接种至试管斜面上，于4℃冰箱中保藏备用。（此过程所需仪器：研钵，移液管，平板，接种环，超净台，酒精灯，试管；此过程中接种操作注意：选取边缘清晰又比较大的菌落，一环下去，能接触到菌落，记住不要插，轻轻碰一下就有几十万个菌，然后迅速转接到试管，整个过程不超过5秒。）２．１.4注意操作：平板划线法与涂布划线法的区别⑴涂布之后整个平板很均匀，划线操作不均匀，只有划线的地方有．⑵涂布的前提是有菌液就能涂布，划线的前提是有菌落存在⑶涂布法简单，均匀，缺点是如果菌液密度大，不适合单菌落⑷划线操作麻烦，但能保证单菌落，分离纯化效率高．2.2纯化内生真菌的方法-PDA培养基的制作方法2.2.1培养基配制方法流程1.洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可）2.用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀3.稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用2.2.2注意事