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实验三、大肠杆菌的转化实验 一、实验目的 学习并掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及外源基因导入细胞的技术 二、实验材料 受体菌种：E.coli JM109 质粒：pUC19 或pUC19-TS LB培养基、Amp母液10万u/ml 其它 三、实验原理 转化是细菌重要的遗传重组方式，也是基因工程的重要技术手段。 大肠杆菌的感受态可以通过用CaCl2在0℃条件下处理细胞而形成。细胞处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变。转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。在LB培养基上培养一定时间后，球形细胞复原并增殖，在选择培养基上便可获得所需的转化子。 四、实验步骤 菌种活化：一环菌接种LB液体培养基，37℃，150 r/min振荡培养过夜； 翻接：接种量5%，37℃ 200rpm培养约70min； 控制OD600=0.2~0.25；将培养液放入冰浴冷却10min 感受态细胞的制备 取1.5ml培养液于于EP管中，10000 r/min，离心30秒，弃上清液；（倒置1min） 加0.75ml预冷100mmol/L CaCl2溶液，用混匀器混匀或用手指弹离心管混匀； 将EP管置于冰浴45min； 6500 r/min，5min离心收集细胞（弃上清），并小心悬浮于0.1ml冷CaCl2溶液中（在冰浴中预冷），用移液器小心混匀； pUC19质粒的转化 分别加两种质粒各1?l ，小心混匀，置冰浴45min； 将离心管置于42℃恒温水浴热处理90s（准确）； 快速转移至冰浴，冷却1~2min 加1ml LB液体培养基，37℃、150 r/min振荡培养45min~1h； 转化子的检出和计数 培养液梯度稀释至10-4，各取0.1ml涂布至LB+Amp平板上；同时取未经转化的细菌培养液0.1ml涂布一块LB+Amp平板进行对照； 将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜 统计药物平板上长出的抗性菌落数 * * *
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