植物基因克隆研究方法综述.docVIP

成 绩 硕士研究生课程论文 课程名称 分子生物学 提交时间 学号姓名 所在学院 任课教师 植物基因克隆研究方法综述 摘要：基因克隆技术诞生至今，获得快速发展，各种克隆方法应运而生。为了纵览植物基因克隆的发展创新历程，本文对各种技术体系，如鸟枪法、文库法、PCR扩增法、化学合成法以及图位克隆法进行了综述。随着后基因组时代的到来，植物基因克隆技术将发挥更加重要的作用。 关键词：基因克隆；鸟枪法；文库法；PCR扩增法；化学合成法；图位克隆法 基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。 采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程叫基因克隆。一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生和状态的转移和重新组合。 2. 2 cDNA 文库法 所谓cDNA文库，是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。这种方法比基因组文库法简单，工作量较少，不包括内含子，以真核生物成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达。因此，在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。cDNA文库通常以λ噬菌体和质粒作为载体构建。构建cDNA文库的一般操作程序如下: (1) 总RNA的提取［4-7］。(2) mRNA的分离。(3) cDNA双链的合成。(4) cDNA与载体的连接。(5) 噬菌体的包装及转染或质粒的转化，形成大量噬菌班或菌落，从而形成以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体即cDNA文库。同样，具备了cDNA文库，就可以用适当的目的基因片段作探针，利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的重组体。最后即可获得所需要的目的基因片段。采用cDNA克隆策略已经到许多种子贮藏蛋白基因［8］，激素或环境胁迫诱导表达基因，国内利用免疫的天麻抗真菌蛋白作探针，通过免疫杂交筛选技术，从表达载体构建天麻的cDNA文库，筛选出天麻抗真菌蛋白基因［9］。 2. 3 电子克隆法 电子克隆法是利用目的基因在其他生物中的同源基因对目的基因所在生物的EST库通过序列比对进行筛选，如果能够得到相似性比较高的EST序列，根据这些EST序列设计引物进行PCR或RT-PCR，就可以得到目的基因片段或全长cDNA，然后通过染色体步移或RACE分别得到全长基因或cDNA［10］。电子克隆，又称计算机杂交（computer hybridization），是以数学算法为手段，以计算机和互联网为工具，利用现有的基因序列、表达序列标签（EST）、蛋白序列和生物信息数据库，发掘新基因，并通过生物学试验进行编码序列和功能验证而克隆基因的方法。电子克隆的理论基础是利用绝大部分功能基因的编码区比较保守，同源性较高的特点，采用生物信息学的手段，通过同源性分析延伸EST序列，以获得基因潜在的部分乃至全长的cDNA序列。电子克隆基因的基本过程：（1）以感兴趣的基因或同源基因的EST为查询序列，用BLASTN检索对应的EST数据库，检出与起始查询序列有同源性或有部分重叠的EST序列，长度＞100 bp，同源性50％～85％。(2)将检出序列组装为重叠群（contig），以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠群系列，重复以上过程，直至没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，获得基因的候选cDNA序列。(3)将获得的候选cDNA序列与GeneBank核酸数据库进行相似性检测。假如没有精确匹配基因，将EST序列数据按EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。基因分折的结果大致有3种：第一是已知基因，是研究人类已鉴定和了解的基因；第二是以前未经鉴定的新基因；第三是未知基因，这部分基因之间无同种或异种基因的匹配