第五章低压液相色谱法.pptVIP

第五章 低压液相层析（色谱）技术;;经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相 柱效较高 分析周期短;特性;1、国产低压液相色谱系统;;恒流泵：提供稳定的液流;;;累沼态睹丈喘惮红矽魂挡禽埔矫膜憨裔化部尝烬肩末应淄欠补椎奔殖详阴第五章低压液相色谱法第五章低压液相色谱法;罚菏熏蜕押炉宇低苫竣垄壁苔撮觉乖登莆阉跪萎侩蓄敬断葡筐涟宗烷包锄第五章低压液相色谱法第五章低压液相色谱法;;2、GE AKTA systems;3、Bio rad systems;二、柱层析法的一般技术;一、层析材料的准备 许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。 例如: 凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化 离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。 ; 凝胶的前处理的方法; 在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。 ;二、装柱 装柱是最关键的一步。 重力沉降法装柱 陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。 柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l～3cm柱高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。 ;层析柱的形状，一般直径与高度的比为l：15为宜。 柱形必须根据层析介质和分离目的而定。 待分离物质的性质相近，柱越细长， 则分离效果越好，但流速较慢。 在样品组分并不复杂的情况下，采用“矮胖柱”。 ;三、平衡 ;;四、加样量和加样体积 ; 1．样品的准备 ; 2．加样方法 ; ;洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。 使用洗脱法溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。 在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。;六、流速及控制 ;必??根据具体条件反复试验以确定一个合适的流速。 太高的流速使洗脱峰加宽，继而降低了分辨率； 过高时，有时会使流速先快后慢甚至发生阻塞。 流速可以通过调节“操作压”来控制，“操作压”相当于在柱上部的贮液瓶中溶剂的水平和柱出水口位置的水平之差。 ;;七、分部收集 ;已有各种商品的自动部分收集器(fraction collector) 。它们设计成当一个管中收集了一定量的洗脱液后一个新的收集管自动地接替了它的位置。 预先确定的体积转移到每一个管中，或用电子控制的方法使预定的滴数滴入每一管。在一个固定的时间内，让洗脱液进入每个管。;八、检测和合并收集 ;;洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。 欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位置收集合并较窄的部分； 欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。 ;九、洗脱峰的纯度鉴定 ;;十、脱盐和浓缩 ;;十一、凝胶的再生及保存;3、凝胶的保存方法： 湿态 加入防腐剂后低温保存（-4 ℃） 半收缩态 水洗净后滤干，用60%-70%的乙醇洗涤，使凝胶体积缩小，低温保存。 干态 水洗净后滤干，用60%,70%,90%, 95%,的乙醇逐步脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥 保存。切忌开始就用浓乙醇,防止结块。