瘢痕疙瘩基因诊断的实验研究.pdfVIP

中英文对照 PaS factorassociatedsuicide自杀相关因子 FasL Fas ligand Fas配体 FasR Fas receptor Fas受体 FasMcabFasmonoclone antibody Fas单克隆抗体 FDD FasDeathDomain Fas死亡域 MPCR reaction mutiplepolymerase 多重聚合酶链反应 SSCP comformation single-strand 单链构象多态性 polymorphism RFLP Restriction FragmentLength 限制性酶切片段 Polymorphism 长度多态性分析 PCR．RFLP PCR产物限制性酶切片段长度多态性分析 SDS 十二烷基硫酸钠 PK K 蛋白酶K proteinase Ep管 Eppendorf管 RNasc ribomucleicacidkinase RNA酶 EB Ethidium 溴化乙锭 revolutionsminute 每分钟转速 Rpm per PAGE 非变性聚丙烯酰胺电泳 摘要 背景：Fas蛋白被认为是细胞凋亡过程中最重要的调控因子之一， 我们前阶段的研究发现，瘢痕疙瘩组织中Fas基因外显子6、8、9存在 突变，而这些突变可能是成纤维细胞凋亡缺陷的主要原因之一，从而导 致了瘢痕疙瘩的发生。 目的：本课题拟建立多重PCR--SSCP反应体系，以达到简便、快速 筛选瘢痕疙瘩Fas基因突变的目的，为进一步研究该基因在瘢痕疙瘩组 织中的突变情况，以及临床上瘢痕疙瘩的基因诊断、手术预测提供实验 基础。 方法：1，本研究拟采用mPCR-SSCP方法。在深入分析了人Fas 基因外显子6、8、9的序列后，按照多重PCR引物设计原则，设计了三 对相应引物；2．先分别找出各外显子的最佳扩增条件，再进行综合分析， 最终得到一个理想的多重PCR扩增条件，以此条件扩增出正常皮肤、增 生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中的目的基因；3．将所得多重PCR反应产物 在单基因对照下进行银染mSSCP分析，进而筛选基因突变。4．将扩增 序列进行测序并与GeaBank中标准序列进行对比以确定突变。 结果： 1。各外显子单一扩增片段和多重PCR扩增条带均清晰，产 量较高，无非特异性扩增，产物长度与理论值一致；DNA测序证实，各 扩增产物即各外显子基因片段：2．经银染mSSCP分析，在正常皮肤组 织和增生性瘢痕中均未检出突变，在23例瘢痕疙瘩标本中，出现异常 电泳带的有18例：3．经测序并分析突变，在单一外显子电泳中，最 高阳性率为52％，在两