选择性遗传标记亲本细胞培养及鉴别.doc

选择性遗传标记亲本细胞培养及鉴别【摘要】在酵母中，呼吸缺陷型突变是经常遇到的。在平皿分离中，会长出约1%的小菌落，这些小菌落丧失呼吸能力。产生这种变异大部分是细胞质基因发生突变，但有时核基因也会突变成小菌落。小菌落突变后，对非发酵型物质如甘油、乙醇、醋酸等不能氧化，但二氧化碳放出高于对照株，酒精脱氢酶活力较对照亦高出1倍左右，对提高酒精产率有好处。本实验用化学诱变方法获得乳白色呼吸缺陷型小菌落，为后续受体原生质体融合育种提供稳定遗传标记菌株。 【关键词】酵母菌；呼吸缺陷型；突变；遗传标记 一、原理 酵母中，呼吸缺陷突变不少。在平皿分离中，会长出约1%的小菌落。产生这种变异主要由于酵母细胞质内作为呼吸酶系的载体，起胞内氧化能转换作用的线粒体发生突变而引起。呼吸缺陷型株具有两个特点，一是不能氧化某些以非发酵型物质作为碳源的物质，如甘油、乙醇、醋酸等；二是酒精脱氢酶活力强，使乙醛转化成酒精的能力增强。因此，可以提高酒精产率。但若其它因素的变化干扰影响了呼吸缺陷型特征的表现，则是需要注意的。 二、材料 1、菌株：Saccharomyces carlsbergensis Hansen卡氏酵母。 2、培养基：MM液（不加琼脂）；CM液：YEPD贮液30ml/L，葡萄糖20g/L，PH 5.0-5.5。 TTC底层：蛋白胨：2.0g/L，酵母膏：1.5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4：0.4g/L，葡萄糖：10g/L，琼脂：20g/L，PH 5.0-5.5 TTC上层：TTC（EMorek）――1，2，3，5氯化三苯基四氮：0.5g/L，葡萄糖：5g/L，琼脂：10g/L 用配量：CM液10ml，TTC底层：150ml，TTC上层：50ml，灭菌：20min，1.8大气压 3、试剂：溴化乙锭，TTC等。 4、器具：无菌吸管、试管、培养皿、三角瓶（250ml）、培养箱、摇床、离心机、灭菌锅等。 三、步骤 1、取10mlCM液体置三角瓶（250ml）接种，振荡培养24hr，离心，6000rpm，10min。 2、取5ml MM液，接种沉淀菌体一环（密度107/ml）+10micro;g/ml溴化乙锭，30℃，振荡培养24hr，避光。 3、第一步：将经溴化乙锭诱变处理并培养24小时后的菌液逐级稀释，取10-4、10-5、10-6稀释液，涂布在TTC下层平板培养皿上，30℃培养2―3天。第二步：在有菌体生长平板上，挑取小菌落，在CM平板上划线标号接种。 4、取溶化的TTC上层降到45℃左右，取约10ml覆盖在TTC底层上面，培养3―5hr。 5、观察菌落颜色变化，菌落变红色的是野生型，乳白色菌落为呼吸缺陷型，记录下白色菌落标号。 6、待点种在CM板上的菌落长出后，选取有标号的菌落（呼吸缺陷型），分别对应在MM和MM甘上点种，培养2―3天，进行生长比较。 7、按对应标号，在CM平板上挑取在MM上生长而在MM甘上不生长的菌落，移种到CM斜面，30℃，培养2―3天，取出到冰箱保存，备用。 四、结果及分析 1、稀释分离后，涂布培养在10-4、10-5平板上有菌落生长出现。 2、覆盖TTC上层后颜色变化，约20%菌落为红色，其余为白色菌落。结果证明，呼吸缺陷型菌株突变率较高，溴化乙锭诱变效果显著。但覆盖TTC上层3―5小时后，随着时间延长，红色菌落开始增多。 3、MM和MM甘平板上生长结果比较。显然呼吸缺陷型菌株不能利用甘油，故不应该生长，所长少量菌落，皆不是缺陷型菌株，而在MM上生长的菌落为所需求的呼吸缺陷型目的菌落（株），故移至CM上的菌落为相对于MM甘空白的标号之菌落。 4、呼吸缺陷型不能行有氧呼吸，不能氧化TTC上层，故其菌落为乳白色，而非呼吸缺陷型为红色或粉红色。由于呼吸缺陷型系线粒体内突变，故该特征在育种上可作为稳定的遗传标记。 5、选出的呼吸缺陷型菌株可用于受体原生质体制备及融合的基因重组试验。 参考文献： [1]沈同,王镜岩,赵邦悌主编.生物化学[M].人民教育出版社. [2]王治权,陈远河主编.啤酒酵母实用技术[M].上海科学出版社. [3]无锡轻院,华南工院,天津轻院,大连工院合编.微生物学[M]. [4]程皆能主编.微生物生理学[M].复旦大学出版社. [5]诸葛健主编.发酵微生物学实验技术[M]. 作者简介：邓进（1963－），男，四川泸州人，内江职业技术学院生物技术系副教授，主要研究方向：食品发酵。 1