麻花艽及管花秦艽(龙胆科)之间自然杂交RAPD分析.docVIP

麻花艽及管花秦艽(龙胆科)之间自然杂交RAPD分析摘要：利用RAPD分子标记技术对同域分布区内麻花艽(Gentiana straminea Maxim.）和管花秦艽（G.siphonantha Maxim.ex Kusn.）及其形态位于二者之间的疑似杂交群进行亲缘关系分析。结果表明，疑似杂交群拥有麻花艽和管花秦艽各自的特征性谱带。表明这些具有中间形态的个体是麻花艽和管花秦艽的自然杂交后代。 关键词：麻花艽；管花秦艽；自然杂交；RAPD 中图分类号：Q945.78 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0053-3 0 前言 自然杂交是高等植物基因组进化和新物种形成的主要动力之一。杂交可以融合亲本种的适应性或创造出新的适应性，为植物抵御不良环境、拓展新生境提供遗传基础[1]。众所周知，生殖隔离和独立的遗传谱系是植物“种”的基本特性之一，但部分亲缘物种之间的生殖隔离可能不彻底，导致自然杂交现象在植物界比较普遍。Ellstrand（1996） [2] 等通过调查发现全世界16-34%科和6-16%属的物种之间存在自然杂交现象。但是，这一比例可能远远低估了自然界中真实存在的杂交现象。主要原因在于植物分类学者在鉴定标本时忽略了标注形态变异的标本有可能是杂交造成的。此外，以往单纯依据形态特征上的居间性判断杂交并不十分可靠[3]。因为居间性也可以通过形态的趋同进化或者环境选择造成的变异产生，而非杂交的结果。相反，一些形态上并非处于亲本种间的个体，却有可能是杂交渗入造成的[4]。近年来，利用各种分子生物学手段不断在以往未曾记载的科属中发现种间自然杂交现象。自然杂交和基因渐渗逐步成为保护生物学、生态学和进化生物学领域关注的热点[5]。 麻花艽（G. straminea Maxim.）和管花秦艽（G. siphonantha Maxim.ex Kusn.）是龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana）秦艽组（sect. Cruciata Gaudin.）内的两个形态近缘种。笔者在青海省曲麻莱县野外考察途中发现在同一草地环境中分布着形态居于麻花艽和管花秦艽之间的过渡类群。其叶的形态与麻花艽相似，而花序和花冠特征位于麻花艽与管花秦艽之间，具有典型的秦艽组形态特征：单轴分枝，莲座丛叶位于植株中心，基部被枯存的纤维状叶鞘包裹。尽管麻花艽的花期较管花秦艽为早，但在同域分布区内三个居群的花期重叠，因此初步推测它们可能是麻花艽与管花秦艽的自然杂交后代。张小兰等（2009）[6]研究表明，秦艽组存在快速成种的现象。物种之间的分化较小，生殖隔离可能不彻底；进一步暗示这些具有中间形态的个体是两个物种杂交渗入造成的。为了验证这个假设，我们选择疑似杂交种及其可能的亲本麻花艽和管花秦艽作为研究对象，试图用RAPD标记技术进一步明确它们之间的亲缘关系，同时，也为其他植物杂交种的鉴定提供有益的参考。 1 材料和方法 1.1 材料来源 研究材料分别采自唐古拉山南北两侧，青海省曲麻莱县同一草地环境生有典型的管花秦艽（顶生花序簇生呈头状，花冠深蓝色、筒状钟形、花萼筒长4-6mm）和麻花艽（二歧聚伞花序，花冠黄绿色、漏斗形、花萼筒长15-28mm）；对于形态介于二者之间的疑似杂交群，主要依据花颜色和花序结构确定：花为紫色、花序介于簇生与聚伞花序之间。在野外仔细观察各居群形态特征后进行群体采样，各居群个体之间的采集距离为10m以上，作为对照，另采有6个不同地区的麻花艽居群。新鲜叶片用硅胶干燥保存。采集的相应标本，经何廷农教授鉴定，两个亲本种的所有标本分别鉴定为管花秦艽或者麻花艽，而中间形态标本则认为是一新变型。凭证标本存于中国科学院西北高原生物研究所标本馆（HNWP）。各居群具体采样情况见表1。 1.2 总DNA的提取 PCR扩增 采用改进的CTAB法从叶片中提取总DNA，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。选择居群间地理位置相隔较远的3个居群做RAPD预扩增，从87个随机引物（购自上海生工）中最终获得了15个扩增条带清晰、重复性好、背景干净的引物。同时找出最佳反应体系和扩增程序。引物及其序列见表2。 反应体系为25micro;l：1×PCR buffer（10 mmol/L Tris?HCl（pH 9.0），50mmol/L KCl， 0.1% Tritonreg; X-100）；2.5mmol/L MgCl2，100micro;mol/L dNTPs，0.5micro;M 引物，1.5units Taq DNA聚合酶，20-40ng DNA模板。反应程序为：94℃60s， 36℃60s，72℃ 90s 2个循环，接以94℃45s，37℃60s，72℃80s38个循环，最后在72