第四章基因工程质粒载体西北师范大学精品课程武国凡基因工程.pptVIP

第四章 基因克隆质粒载体 引子 第一节　质粒的一般生物学特性 4.1.2 质粒编码基因表达的某些表型特征 4.1.3 质粒的转移 4.1.3.2 F质粒 4.1.3.3 质粒DNA的接合转移作用 4.1.4 质粒DNA的迁移作用（mobilization） 4.1.5 质粒的不亲合性 第二节 质粒DNA的复制与拷贝数控制 4.2.2 质粒拷贝数控制 4.2.1.1 质粒拷贝数的控制方式 4.2.1.2质粒拷贝数控制分子模型1—蛋白质稀释模型 4.2.1.2 模型2—自体阻遏蛋白质模型 第三节 质粒DNA的分离与纯化 第四节 质粒载体的构建及类型 4.4.2 天然质粒作为载体的局限性及改造策略 4.4.3 质粒载体的选择记号 4.4.4 质粒载体的类型 质粒的命名 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。 第五节　 重要的大肠杆菌质粒载体 ●他们首先检查了EcoRⅠ对质粒pSC101和R6-5的切割情况，发现EcoRⅠ在质粒pSC101上只有一个切点，在质粒R6-5上有12个切点,这样就可以用pSC101作为重组DNA的载体分子。 pBR322的基因克隆 pUCl9重组子的蓝 / 白斑筛选 返回第四章 4.5.1 质粒载体 pSC101、pSC102 严紧型复制 低拷贝 第一个成功应用于克隆真核DNA,1973, Boyer and Cohen 返回第四章 Boyer and Cohen 的策略 返回第四章 pSC102,体内构建的重组体 用EcoRⅠ处理过的和没有处理过的 质粒pSC101和R6-5DNA分别转化E.coli,得到下表的实验结果∶ 1.3×104 1.3×104 ---- R6-5(未切割) 氯霉素 卡那霉素 四环素 4×101 1×102 ＜5 R6-5 (EcoRⅠ切割) --- --- 2.8×104 (EcoRⅠ切割) --- --- 3×105 pSC101(未切割) 每μg DNA转化子 质粒DNA 从用EcoRⅠ处理的R6-5的卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并检查了它的抗性，发现该克隆同时具有磺胺的抗性，但没有氯霉素、四环素的抗性。从该克隆中分离了一个环状质粒DNA，命名为pSC102。 图4-18，p210 返回第四章 返回第四章 研究最多、使用最广泛。 BR代表研究出这个质粒的研究者Bolivar和Rogigerus。 4363bP，含有两个抗生素抗性基因(Amp和Tet)； 有单一的BamHI、HindIII和SalI的识别位点。 带有一个复制起点，在大肠杆菌里，以高拷贝数存在。 4.5.2 pBR322 返回第四章 pBR322质粒载体的结构来源，215页 Tetr Ampr Ori 返回第四章 返回第四章 西北师范大学 精品课程 武国凡 基因工程 第四章 基因工程质粒载体 西北师范大学 精品课程 武国凡 基因工程 第一节　质粒的一般生物学特性 第二节　质粒ＤＮＡ的复制和拷贝数控制 第三节　质粒ＤＮＡ的分离和纯化 第四节　质粒载体的构建及类型 第五节　重要的大肠杆菌质粒载体 限制性片段，连接进载体后，形成多个重组DNA分子 将外源DNA带进宿主细胞 提供使重组DNA分子在宿主细胞中保存下去所需的生物学功能 通常用质粒、噬菌体和病毒 4.1.1 质粒DNA：都有一段DNA复制起始位点序列 1、F因子(致育因子)：F+（♂）；F-（♀）；Hfr. 2、R因子(耐药性)： 3、Col因子：可以使不带有Col质粒的亲源关系密切的菌株致死的蛋白质. 4、青霉素酶质粒： 5、Ti质粒(诱癌质粒)：植物基因工程重要载体。 6、降解质粒： 7、其它：隐蔽质粒、表达质粒、分泌质粒等。? 返回第四章 抗性特征 抗菌素抗性 氨苄青霉素、氯霉素、四环素、链霉素抗性等 重金属抗性 汞\镍、钻、铅、锑、锌等金属抗性 毒性阴离子抗性 砷酸盐、亚砷酸盐、亚硫酸盐、硼酸盐等 其它 嵌人试剂（EB）、辐射、噬菌体及细菌素、质粒特异的限制／修饰体系抗性 代谢特征：抗菌素及细菌素的合成；碳水化合物、蛋白质、冠瘦碱的新陈代谢；固氮作用、H2S的合成； 修饰寄主生活方式的因子 毒素的合成--大肠杆菌肠毒素合成； 金黄色葡萄球菌--剥脱性毒素的合成， 植物之冠座病和发根病；豆科植物的感染与结瘤 其它特征 盐杆菌---细胞中气泡的形成； 豌豆根瘤菌的根际蛋白质合成； 返回第四章 Col质粒 自主复制基因，转移基