靶向Annexin A3短发夹环RNA干扰载体的构建及鉴定.pdfVIP

安徽农业科学，Journal ofAnhui A ．Sci．2008，36(17)：7145—7146，7246 责任编辑 张杨林 责任校对 况玲玲 靶向Annexin A3短发夹环RNA干扰载体的构建及鉴定 席仁荣 2，刘建军卜，吴振强2，邢秀梅 ，黄海燕 (1．深圳市疾病预防控制中心毒理研究室，广东深圳 518020；2．华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 518640) 摘要 [目的】利用RNA ff-4~L(RNA interfering，RNAi)技术构建和鉴定膜联蛋白A3(Annexin A3)的真核表达栽体，为进一步研究 Annexin A3在肝细胞中的功能奠定基础。[方法】人工合成3对shRNA序列，退火后定向克隆到真核表达载体psiRNA—hHlneo上，采 用酶切和测序法鉴定。[结果】质粒酶切及测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。[结论】成功构建膜联蛋白A3靶向的真核表 达栽体。 关键词 Annexin A3；psiRNA—hHlneo；RNA干扰；真核表达栽体 中图分类号 Q782 文献标识码 A 文章编号 0517—661 1(2008)17—07145—02 Construction and Identification of shRNA Eukaryotic Expression Vector Targeting Annexin A3 XI Ren~ong et aI (Department of Health Toxicology，Shenzhen Center for Disease Control and Prevenron。Shenzhen。Guang dong 518020) Abstract 『0biective1 The aim of this Paper was to construct and identify the siRNA eukaryotic expression vector targeting annexin A3． 『Methods1 Four shRNAs were designed according to the coding sequence of annexin A3 gene，and cloned into the downstmam of H l promoter of psiRNA-hHl-neo．The constructed recombinant was analyzed and identified by Ase I endonuclease digestion and DNA sequencing．『Results1 The constructed psiRNA plasmid digested with Ase 1 was linearized．The sequencing result confirmed that the sequence of inserted fragment Was correct．『Conclusion1 Eukaryotic expression vector of siRNA targeting annexin A3 gene was successfully constructed． Key words Annexin A3；psiRNA-hHlneo；siRNA：Eukaryotic expression vector 近年来，由三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)引起的中 毒事件屡见报道，但其中毒机制尚不清楚。研究者曾建立了 TCE致肝细胞损伤模型，并通过蛋白质组学筛选出一批可 能成为标志物的候选蛋白[1j，其中Annexin A3在TCE处理 后高表达，目前尚不清楚其在TCE致肝细胞损伤中的确切 功能。该研究采用分子克隆技术构建了针对Annexin A3的 干扰RNA片段(siRNA)真核表达载体，通过酶切鉴定和测 序鉴定其结构，旨在为后续功能研究奠定基础。 1 材料与方法 1．1 材料 质粒DsiRNA-hH1 neo由深圳市疾病预防控制 中心毒理研究室保存，其带人H1启动子，Geneticin(G418， 一 种氨基糖苷类抗生素)抗性基因，并且带有Bbs I和Ase I 酶切位点(图1)；限制性内切酶Bbs I和Ase I、DNA凝胶 回收试剂盒购自美国MBI Fermentas公司，DH-Set、T4 DNA 连接酶购自宝生物公司，高纯质粒提取试剂盒为Omega公