低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究摇.pdf

第44卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 研究报告 第8期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2016年8月 ChineseJournal of Analytical Chemistry 1193~1199 DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.160139 低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究 1 1 2 1 3 *3 *1 王子健摇 杨静波摇 李光谱摇 孙宁宁摇 孙万春摇 彭其胜 摇 刘 宁 1 2 (吉林大学第二医院,长春 130041)摇 摇 (吉林亚泰生物药业股份有限公司,长春 130033) 3(吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062) 摘摇 要摇 采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI鄄TOF MS)和纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质 谱(Nano鄄ESI 鄄QTOF MS)技术,以标准肽段和流感病毒基质蛋白酶切肽段为模型,研究了甲醛对蛋白质和多 肽主链的修饰作用。 采用与实际病毒灭活过程一致的实验条件(4益,0.025%(V/ V)福尔马林(37%(w/ w)甲 醛溶液)处理72 h),进行甲醛与多肽的化学反应。 结果表明,在实验条件下,甲醛能与标准肽段N端的氨基 反应生成羟甲基加合物,再发生缩合反应生成亚胺,形成+12 Da 的产物。 此外,甲醛还能与标准肽段中的精 氨酸、赖氨酸的侧链发生反应,生成+12 Da 的反应产物。 对流感病毒基质蛋白的酶切肽段与甲醛的反应的 质谱分析结果显示,多数的肽段都生成了+24 Da 的产物,质量的增加来源于肽段N端氨基(+12 Da)和C端 精氨酸或赖氨酸的侧链(+12 Da)的贡献。 此外,还观察到有一个漏切位点的肽段生成了+36 Da 的产物。 本 研究结果表明,在实验条件下,低浓度甲醛主要与肽段和蛋白的N 端氨基,以及精氨酸和赖氨酸侧链发生反 应。 本研究为分析低浓度甲醛与蛋白质的反应产物提供了有效的质谱分析方法和解谱依据。 关键词摇 甲醛;多肽;基质蛋白;化学修饰;质谱 1摇 引摇 言 在生物医学领域,甲醛被广泛用于临床组织样本的固定,以及毒素和病毒的灭活等。 甲醛能与生物 大分子尤其是蛋白质的活性基团发生反应,从而将蛋白质交联、失活,甚至固定。 在致病微生物尤其是 高致病性微生物(如禽流感病毒)的研究中,经常使用一定浓度的甲醛溶液处理样本,使微生物中的遗 传物质RNA、DNA发生化学修饰、交联反应,使微生物失去遗传信息复制及繁殖的能力。 近年来,由于变异而产生的各种新型流感病毒不断引起大规模地区性、乃至全球性的流感爆 [1,2] 发 ,因此,对流感病毒特别是禽流感和新型甲型流感病毒重要编码蛋白的结构和功能以及与感染细 胞相互作用机制的研究,已经成为目前的研究热点之一[3~6]。 对流感病毒主要蛋白一级结构的研究,通 常采用分子生物学方法对病毒基因序列进行测序,进而间接推导出蛋白质的氨基酸序列。 而现代软电 [7,8] 离质谱技术可以直接对蛋白进行分析、测序,不但能直接得到蛋白质一级结构的序列信息 ,还能对 蛋白的翻译后修饰等方面的信息进行直接表征[9~11] ,可以得到比传统的基因测序技术更直接和丰富的 结构信息。 然而,由于新型甲型流感病毒的高致病性,病毒样品必须经过严格的灭活,使病毒核酸或蛋 白分子发生化学修饰,使病毒失去繁殖力,才能在开放实验室进一步分析研究。 已有的研究[12,13]表明,甲醛最容易与氨基酸上的氨基发生反应生成羟甲基加合物,再发生缩合反