多组化膜蛋白体定量策略.pdf

週報 第 1240期 知識天地 多組化膜蛋白體定量策略：探索自體顯性遺傳之多囊性腎疾病的藥物標的蛋白質 陳玉如副研究員（化學研究所） 摘要 許多膜蛋白質的異常表現被報導和疾病相關，因此，全面性地定量膜蛋白體可增進我們對膜蛋白質調控疾病 的機制及其訊息傳遞的了解。我們實驗室針對膜蛋白體提出新穎多組化膜蛋白體定量策略，並應用於具有自體顯性 多囊性腎臟病的小鼠，找出104個異常變化的蛋白質，其中有部分蛋白質已被使用為治療此疾病的藥物標的分子。 藉由此定量平台的研究不僅闡釋了疾病之可能致病機制，也發現其他可能被使用於治療或診斷疾病之標的蛋白質。 細胞膜是細胞的基本組成物質之一，膜蛋白質介於細胞與外界溝通的介面，掌控了很多重要的細胞功能，例 如：訊息傳遞、細胞間交互作用、吸收和分泌物質等；此外膜蛋白質與新藥開發及製造有密切的關係，也是許多疾 病在臨床診斷與治療的標的分子，目前市面上的藥物有三分之二即是針對膜蛋白質所研發而來，儘管膜蛋白質在細 胞中扮演重要的角色，但不論在生化特性、結構及拓撲學（topology ）上的研究卻嚴重缺乏，造成此現象之原因在 於膜蛋白質具有高疏水性及低含量的特性，使得膜蛋白質在樣品製備、處理、分離及分析上有許多的限制，造成膜 蛋白質研究的困難。 近10年來，由於幾種重要的生物基因體定序陸續完成，蛋白體學成為後基因時代生命科學領域最重要的課題 之一，以質譜為主的技術平台已成為研究蛋白體學的主力工具之一。質譜技術能對大量蛋白質進行快速、靈敏的鑑 定及定量分析，對蛋白體學的研究造成革命性的衝擊，但是在進行質譜儀分析前所需要的膜蛋白純化、溶解及分離 仍然是一大瓶頸，要得到全面的膜蛋白體分析更是困難。現今常用的膜蛋白體定量分析方法可分為：以凝膠技術為 主及以液相層析技術為主的兩大方向，搭配質譜儀的分析便可解析出一生物體的膜蛋白質，這兩類方法各有不同的 優劣，可依不同實驗需求來選擇適當方法。 在凝膠技術上最常見的是二維膠體電泳法(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)或是二維螢光差異膠體電 泳法（ 2-D fluorescence difference gel electrophoresis ）。分析物以2DE分離，利用影 像分析找出表現量變異的點，經由in-gel digestion後得到的胜胜以質譜儀分析，再與 蛋白質資料庫比對即可鑑定其中的蛋白 質，此方法是目前蛋白體研究上最被廣泛應 用的技術。在膜蛋白體的研究上，早在1979 年時Charron等人成功地以2DE分離了人類B 細胞的膜蛋白質1 ；Jang等人在2003年也以 2DE分離血癌病人的B細胞群的膜蛋白體了 解病人的膜蛋白體變化2 ，以便藉此研究藥物 治療的標的蛋白質。雖然2DE可以提供完整 的蛋白質地圖，幫助我們瞭解蛋白質表現、 異構物組成及轉譯後修飾程度的變化，但 2DE 的許多缺點限制了其在膜蛋白體的應 用，包括對於高酸性或鹼性的蛋白質及分子 量極小或極大的蛋白質無法有效的分離、實 驗流程耗時、實驗重複性差；此外，因為受 1 週報 第 1240期 限於染色技術的靈敏度或是樣品中含有大量高含量蛋白質，低含量蛋白質將難以偵測；而疏水性的膜蛋白質因為溶 解度差，不容易在膠體上出現，即使如此，2DE仍然是分析膜蛋白質的主要工具之一，但相較於其應用在細胞質蛋 白體上的研究，2DE在膜蛋白質的成果仍是遠遠落後。 液相層析法配合串聯式質譜儀(LC-MS/MS)可以解決許多2DE分析的限制，尤其是奈流毛細管液相層析質譜 (nanoflow LC-MS/MS)的應用顯著地增加蛋白體分析的速度與靈敏度，並可達到自動化及高通量(high-throughput)的 目的。實驗流程為：蛋白質樣品溶於適當的溶劑後，直接在液相中進行酵素水解，得到的胜胜混合物利用離子交換 層析管柱和逆式液相層析管柱分離，接著進入質譜儀分析，並與蛋白質資料庫比對後可鑑定蛋白質。由於膜蛋白質 具有高疏水性的特點，我們常利用介面活性劑（如：S