实验八蛋白质定量（微量）分析---elisa reader应用.doc

實驗八　蛋白質定量（微量）分析---ELISA reader應用 ※結果： 編號 吸光值 吸光值 吸光值 平均 濃度 0 0.066 0.065 0.069 0.066667 0 0.2 0.204 0.177 0.204 0.195 0.2 0.4 0.284 0.237 0.296 0.272333 0.4 0.6 0.392 0.502 0.597 0.497 0.6 0.8 0.493 0.485 0.503 0.493667 0.8 1 0.829 0.69 0.596 0.705 1 1X 1.283 1.396 1.107 1.262 1.946429 5X 0.381 0.388 0.445 0.404667 0.554654 20X 0.156 0.191 0.193 0.18 0.189935 計算未知液稀釋前濃度： 5X→0.312875×5=1.564375 20X→0.17448×20=3.4896 1X未知液濃度不在檢量線範圍內，因此不予計算 計算未知液濃度平均值 (1.564375+3.4896)÷2=2.5269875 圖表 ※討論： 1.檢量線不直，有部分不在線性上，也就是吸光值不是很準確，也許是稀釋時操作錯誤未震盪均勻，液體量取錯造成的，若是微量滴定盤不淨也可能會影響吸光值的測定。 2.計算出的未知液濃度差距太大，也許是因為操作錯誤，取量錯誤，容器清洗不淨，或是檢量線不完全在線性上造成計算時產生的誤差，因此本組的未知液濃度不夠精準，必須要再次實驗才能確認此未知液真正的濃度為何。 3.本次實驗使用的是微量滴定盤，於ELISA reader光度計測吸光值，它不同於分光光度計的是它不像分光光度計是要將液體分裝置小的測光管內，一管僅能放一種液體，分好幾管容易混到或者打翻，且測光管有分透光面及不透光面，擺放錯誤或有汙漬也無法測得準確的吸光值，而ELISA reader光度計只要將液體都裝在96孔的微量滴定盤內，放進儀器內測量即可，所以準確度及方便度都比分光光度計來的方便許多。 4.此次實驗結果不是很理想，是稀釋錯誤嗎？但本組的操作是每次稀釋都有換微量吸管頭的，因此實驗結果不理想實在很難理解，也許真的是沒有混勻吧！ ※實驗問題： 1.請說明本分析方法的原哩，並特別以蛋白質構造來說明。 CBG有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當CBG接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供CBG一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的CBG也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。 實驗九　醣類的鑑定反應-醣的呈色反應和還原醣的檢驗 ※結果： H2O Xylose Glucose Fructose Lactose Sucrose Starch Albumin 紅８ Molish － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ Iodine － － － － － － ＋ － ＋ Benedict － ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － Barfoed － ＋ ＋ ＋ － － － － － ※討論： 1. Molish Test中是利用硫酸將醣類脫水產生furfural或其衍生物，在與α-萘酚產生具有鮮明顏色物質，因此是用來測定容易中是否含有碳水化合物；結果顯示除了水以外的溶液皆呈陽性反應，因此都含有碳水化合物。 2. Iodine Test中是利用碘會與澱粉及肝醣形成錯合物，若溶液中含有支鏈澱粉或肝醣則此錯合物會呈紅棕色，若溶液中含有直鏈澱粉則錯合物會呈藍色，若溶液中兩者都有則錯合物會呈紫色；結果顯示只有澱粉及未知溶液呈現紫色，因此可以肯定的推斷此未知溶液就是澱粉溶液。 3. Benedict Test中是利用游離醛或酮將鹼性之銅還原（或醣被氧化），形成黃色至磚紅色之氧化亞銅，是用來測定溶液中是否有還原醣存在；結果顯示木醣、葡萄糖、果糖及乳醣皆有呈色，為陽性反應，其餘為陰性反應，因此可推定未知液不屬於還原醣。 4. Barfoed Test中是利用Benedict Test原理但在酸性環境使銅離子能測出單醣，溶液中若含單醣則在加熱時短時間內（約5~7分鐘）會產生紅色沉澱，溶液中若含雙醣則在加熱時一段時間後（約7~12分鐘）會產生大量沉澱（蔗糖除外）；結果顯示木醣、葡萄糖及果糖呈現陽性反應，其餘呈現陰性反應，可以推定未知溶液不為單醣。 5.以上種種試驗結果要推斷出未知溶液為何種醣類，首先我們可以確定未知溶液一定含有碳水化合物，再來可以確定未知溶液與碘呈陽性反應，接著我們知道未知溶液不屬於還原醣，最後又得知未知溶液不為單醣；將還原醣及單醣排除，剩下三種可能蔗糖、澱粉及白蛋白，但又因其能與碘產生反應，因此可推定未知溶液