非小细胞肺癌尿蛋白质组双向电泳 - 第三军医大学学报.doc

非小细胞肺癌患者尿蛋白质组双向电泳方法的建立 张渊 代义李艳艳 邱宗荫* （重庆医科大学药学院，重庆 400016） [摘 要] 目的 建立与优化非小细胞肺癌（NSCLC）患者尿液全蛋白双向凝胶电泳技术( 2-DE)。方法 采用4种不同的方法制备尿液蛋白质样品，以非线性预制胶条进行第一向等电聚焦，12％SDS进行第二向电泳，银染显色。结果 以乙腈蛋白后超滤制备蛋白质，00μg上样量时，可获得图像清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。结论 建立了较稳定的非小细胞肺癌患者尿蛋白质组双向凝胶电泳技术，为进一步开展疾病的尿液蛋白质组学研究奠定了基础。 [关键词] 非小细胞肺癌；尿液；双向电泳 在世界范围内，肺癌的发生率居恶性肿瘤第二位，但为恶性肿瘤死亡的首要原因。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的80%，其疗效令人失望，美国5年生存率为15%，欧洲为10%，发展中国家甚至低于8.9%。我国是肺癌的高发国家，其发病率及病死率均居癌症的首位。复发和重要器官的转移是治疗失败的主要原因，虽然手术是其首选治疗方法，但大多数患者确诊时已属晚期而失去手术机会早期诊断肺癌的 尿液是血液经肾小球滤过，肾小管和集合管重吸收、排泄及分泌产生的终末代谢产物组成与性状不仅可反映泌尿系统的状况，也能反映循环系统的状况又因为尿能够无创地大量获得，并且相对于其它生物液体而言比较稳定，因此尿蛋白质组学研究[1]。双向凝胶电泳技术(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE)是的主要技术之一。要获得具有高分辨率和重复性的双向凝胶电泳图谱，样品制备是关键[]。尿液成分复杂，含有的多种盐分和代谢产物影响蛋白质的分离，目前国内外研究者对于尿液蛋白质的制备尚无统一方法[]。 本实验以健康对照者和NSCLC患者尿液为研究对象，对2-DE条件进行调整、优化，获得了较稳定的NSCLC患者尿液2-DE图谱，为进一步开展疾病的尿液蛋白质组学研究奠定了基础。 1 材料和方法 1.1主要材料 尿素，3-[ (3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS，十二烷基硫酸钠(SDS)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，甘氨酸，过硫酸氨，碘乙酰胺，四甲基乙二胺(TEMED)及pH 3～10 IPG胶条等(美国Bio-Rad公司)；二硫苏糖醇 (DTT)，甲叉双丙烯酰胺，硫脲Bradford蛋白质定量试剂盒（上海生工公司）。 1.2 主要仪器 双向电泳仪：PROTEAN IEF Cell，PRPTEAN II Xi Cell为美国Bio-Rad公司产品；PDQuest software 7.0 为美国Bio-Rad公司产品。 1.3 方法 1.3.1 尿液采集 于清晨采集8例健康志愿者(4男4女，无严重系统性疾病，一周内未用药，无吸烟史，女性不在月经周期内)的第一次中段尿样各约100ml，等量混合，立即加cocktail蛋白酶抑制剂[]，于－80℃贮存。 NSCLC患者尿液标本取自重庆医科大学附属第一医院呼吸内科住院患者的晨起中段尿，经肺组织活检病理检查确诊为NSCLC患者，且尚未进行药物和手术治疗。 1.3.2 样品处理 方法1冷冻干燥后直接上样 将解冻后的样品于室温1500×g离心10min，去除细胞碎片及不溶性杂质，μm滤膜过滤后真空冷冻干燥，用上样缓冲液(7 M 尿素，2 M 硫脲，4% CHAPS)溶解，低温超声溶解10分钟，Bradford法定量蛋白质。 方法2 沉淀蛋白后直接上样 将解冻后的样品于室温1500×g离心10min，去除细胞碎片及不溶性杂质μm滤膜过滤。取20mL样品加预冻的乙腈1:5（样品：有机溶剂）于4℃沉淀过夜后，4000×g，10℃离心40min，弃上清，将沉淀物真空干燥。用上样缓冲液(7 M 尿素，2 M 硫脲，4% CHAPS)溶解，低温超声溶解10分钟，Bradford法定量蛋白质。 方法3 冷冻干燥后超滤 将解冻后的样品于室温1500×g离心10min，去除细胞碎片及不溶性杂质，μm滤膜过滤。取20mL样品直接冷冻干燥后用上样缓冲液(7 M 尿素，2 M 硫脲， 4% CHAPS)溶解，低温超声溶解10分钟使用Millipore超滤管 Amicon Ultra-10K（Billerica，MA，USA），以超速冷冻离心法（4℃，4000×g，离心2h）浓缩至500μl左右,以去除小分子干扰物质，用Bradford法定量蛋白质。 方法4 沉淀蛋白后超滤 将解冻后的样品于室温1500×g离心10min，去除细胞碎片及不溶性杂质μm滤膜过滤。取20m样品分别加预冻的乙醇、丙酮、乙腈1:5（样品：有机溶剂）于4℃沉淀过夜后，4