中华大学生物资讯学系系统开发专题报告建构ta 克隆蛋白表达载体 .pdf

中華大學生物資訊學系系統開發專題報告 建構 TA克隆蛋白表達載體 Construct TA cloning expression vector 專題組員 呂邦愷、韓宗亦、溫啟東: 專題編號： PROJ2013-BIOINFO-9903 指導老師張慧玫: 老師 1. 摘要 3’端多出一個T 來接合崁入的目標基 建構蛋白表達型 TA克隆載體是 因。 我們這次研究的目標，主要是將 3. 專題進行方式 pET23a載體改版 ，pET23a除了有複製 的功能以外，還能夠表達蛋白質。 TA 載體在接上外源基因 PCR 產物時有 50%的成功機率， 而一般載體要接上外 源基因 PCR 產物卻非常困難 。我們先 破壞 pET23a在 Amp 基因上的內含 AhdI位點 ，在克隆區位加 2個 AhdI 位點成可用的 TA載體 ，其可行性測 試則是利用模通透性測試檢測功能 ， 圖一：流程圖 若外源基因抗菌蛋白被成功接入我們 的 TA載體 且被表達，則用肉眼即可看 (1) :抽 pET23a的 plasmid DNA 出細胞被染成藍色的，而也代表我們 養菌 600ml LB/Amp 培養液 ，使 所做的 pET23a_TA_cloning_vector改 用 solution I ，II ，III抽 plasmid DNA 。 版成功後以 TA 突端接受崁入基因，並 DNA 沉澱1hr或是 overnight ，沉澱完 可將崁入基因表達成蛋白質 。 烘乾回溶，降解RNA ，再以1 : 1體 2. 簡介 積 phenol /chloroform 酚( /氯仿 )清除 TA克隆載體 ： 蛋白質 ，上層為包含DNA 之上清液， 常見的克隆載體，大致可分為兩 中層為蛋白質與細胞碎片，下層為 酚( 類，一類的功能主要為大量複製目標 /氯仿 )有機溶劑 。取上清後加酒精， 基因DNA ，另一類的功能除了能夠進 沉澱1hr後回溶 DNA在 TE 緩衝液 。 行複製以外，還可以表達目標蛋白 以 取微量 DNA跑電泳，照膠後算出 測試目標蛋白的功能 。 濃度，可以精準的加入定量的限制 目前常見的克隆是將目標基因以 酶 ，挪移去除AhdI位點的 Amp 基因 PCR (聚合酶)連鎖反應擴增出來，但是 片段從 pUC19置入，建構無 AhdI的 擴增後的 DNA片段常會被 Taq聚合酶 pET23a ，使pET23a的骨架在 Amp 基 額外載 3’端多加一個 A鹼基。我們 因上其 AhdI 切點也被破壞 ，pET23a 專題目標是做出一個可直接接入 PCR 大小片段約3.666k ，跑膠時可清楚看 產物的 TA 蛋白表達載體，他必須在 到band 帶。 IA3-4-009-A 生四種配對情況 (2) : TA改版 PCR結束我採用自然降溫法，把 ※設計的 pET23a_primer_deAhdI由 兩管產物放置已沸騰的水中20 分鐘， single-primer PCR 來大量複製改版 然後放置冰上5 分鐘，再將兩管加成 載體