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斯丹赛生物技术有限公司 TALEN技术介绍 专业 专心 专注 联系电话：010京） 021上海） 邮箱：hedengsheng.happy@163.com beijing@ 北京办事处：北京市海淀区青云北区11号楼2单元31号 公司地址：上海浦东新区张江高科技园区蔡伦路720弄1号楼313室 传真： 010北京)；021上海）公司网站： TALEN技术简介 TALE（Transcription activator -like effectors）是一种源于植物致病菌Xanthomonas的崭新的靶向基因操作技术。研究证明TALE蛋白的氨基酸序列与靶位点的核酸序列具有恒定的对应关系，一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。研究者通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。 TALEN技术可对任何物种中的基因进行靶向的knock-out和knock-in，可完全避免RNAi的干扰不完全，稳定性差等缺陷,一种革命性的基因工程技术。 TALEs首先是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现的，特异性地结合到DNA，在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。 每个TALE含有一个位于中央的重复区域，该区域由通常为33-35氨基酸的数量可变的重复单元组成。这是这种重复序列结构域(repeat domain)负责识别特异性的DNA序列。每个重复序列基本上都是一样的，除了两个可变的氨基酸，即重复序列可变的双氨基酸残基(repeat-variable diresidues, RVD)。TALE识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被一个重复序列上的RVD识别。 一个TALE上用于序列特异性识别的DNA结合结构域融合到一个在DNA序列产生双链断裂(double strand break, DSB)的内切核酸酶的催化性结构域，便产生了TALEN。TALEN的DNA结合结构域能够在一个较大的识别位点进行高精确的定向结合。 TALEN被定义为异源二聚体分子(两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域)，能够切割两个相隔较近的序列，从而使得特异性增强。它在用于基因组订制化(genome customization)方面表现出较高的效率和潜力。?尽管与锌指蛋白存在一些类似性：都是在自然中发现的、模块化的而且还具有自然的DNA结合特异性---，但是也存在较大的差别。锌指模块识别三联体碱基，而TALE结构域识别单个碱基。这就意味着人们只需要结合较少的锌指模块实现比较可观的特异性。比如，含有3个锌指模块的蛋白识别9到10个碱基对片段，但是它将需要9个重复的TALE来识别。但是三个锌指模块串联也意味着在识别序列如何识别上存在更少的灵活性，而且尽管有上百个锌指模块存在，但是仍然不能代表每个可能的序列。因此，研究人员不得不开发出方法来鉴定锌指模块可靶向的目的基因内部的序列，然而至少在理论上和大多数实践中，人们应当可以获得使用TALE时所需的任何序列。即便是最为忠诚的锌指狂热爱好者也会说，锌指模块不能靶向所有的序列。另一方面，TALE工作者正取得显著的成功。简而言之，对锌指模块而言，人们不得不让DNA指出需在何处靶向，但对TALE而言，是研究人员，而不是DNA，决定靶向何处。 另一个不同之处在于锌指模块需要大量优化才实现特异性基因打靶，然而TALE似乎即设计即使用就可以非常好地发挥作用。比如，对于多个锌指模块串联而言，锌指模块之间的相互作用能够降低它们的特异性，然而迄今为止，这种背景依赖性在TALE中尚未报道过。锌指结构域另一个的缺点在于当和FokI核酸酶融合从而形成基因编辑工具ZFN时，偶尔会发生脱靶切割和产生毒性。脱靶切割部分是由于锌指结构域的非特异性结合，部分是由于FokI核酸酶导致的。因为FokI必需形成二聚体才能具有活性，需要两个结合相邻位点的锌指结构域切割双链DNA。当两个锌指结构域在细胞中表达时，同源二聚体和异源二聚体通过FokI结合域的结合而形成，但是只有异源二聚体具有所需的特异性。因而，同源二聚体的存在提高不想要的结合的背景水平。几个研究小组已经设计出改造过的FokI二聚体界面以便尽量产生异源二聚体，可以降低但是不能完全消除脱靶切割。 奇特的是，当TALE即便是与野生型FokI融合产生TALEN，毒性可能很少是一个问题。TALE的脱靶效应尚没有进行仔细分析，但是当使用不是异源二聚体的锌指结构域时，人们能够观察到明显的毒性。对TALE而言，大多数研究都是用它的野生型界面。TALE