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绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测 绿色荧光蛋白（GFP） GFP 实验流程图 一、实验目的 1.熟悉转化表达的过程。 二、实验材料与用具 1、 菌种 （1） E.coli DH5α(pETH）菌株 （2）E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 （3）E.coli BL21菌株 （4）E.coli BL21 (pETH）菌株 （5）E.coli BL21 (pETH-GFP）菌株 三、实验原理与方法 （一）质粒的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 碱裂解法提取质粒DNA的原理 §1、用试剂盒提取质粒DNA 酶切反应 每 20ul 酶切体系所需材料 无菌ddH2O 2ul 质粒DNA 15ul 10×Buffer 2ul EcoRI 1ul 总计 20ul 置37℃温箱酶切2hr。 酶切片断的电泳检测 制备0.8％琼脂糖凝胶板，加入适量的EB。 向酶切管里加入适量溴酚蓝，全部取出点样。 （二）感受态细胞的制备及转化 CaCl2法制备感受态细胞原理 CaCl2法制备感受态细胞操作要点 §2、氯化钙法制备感受态细胞 §3、转化 （三）GFP的诱导表达 §4、诱导表达 乳糖操纵子（Lac operon）的结构及阻遏作用 工程菌E.coli BL21(pETH-GFP)的表达原理 § 5、制备细胞裂解液 （四）聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） SDS§ 6、加样、电泳 （五）免疫印迹（ immunoblotting ）  蛋白质印迹电转移 § 7、转膜 五、注意事项 Acr, Bis具有神经毒性，实验中应带手套操作。 待分离样品的质和量直接影响电泳效果。 如待分析的蛋白质分子量大，转移时间需延长。 电泳转移操作时，确保滤纸、膜、凝胶其间无气泡存在。 六、思考与讨论 题 是目前对蛋白质进行分离，纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。 聚丙烯酰胺凝胶：由丙稀酰胺（Acr)单体和少量的交联剂——亚甲基双丙稀酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构。 引发剂（NH4)2S2O8在凝胶形成中提供始自由基，通过自 由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。 加速剂 TEMED 则可加快引发剂放自由基的速度。 通常采用不连续电泳系统，通过电荷效应，浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。 SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，可使蛋白质的氢键和疏水健打开，与之形成蛋白质－SDS复合物。由于SDS带有负电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差异，使蛋白质分子在凝胶中的迁移率主要取决于它的分子量。 拔掉梳子 将玻璃夹板、电泳槽内芯、玻璃夹板依次放入槽内 插入楔型板 加注电泳缓冲液 每孔加样20μl 盖好上盖，恒压电泳，40-45V 溴酚兰前沿到底部，终止电泳。 取下凝胶，浸泡于蒸馏水中，紫外灯下检测 （短玻板一面朝内） 约3小时 1块胶／组 每块胶上，一个阴性对照，一个阳性对照 每人点1个原液，1个倍比稀释液。 （16μl裂解液＋4μl上样缓冲液，混匀） （液面高于短玻板，低于长玻板） 又称蛋白质印迹（Western blotting），是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。 免疫印迹技术结合了电泳分辨率高及免疫组化特异性强的双重优点，是目前蛋白质研究工作中的重要手段之一。 蛋白质样品经电泳分离 将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上 硝酸纤维素膜(Nitrocellulose，NC) PVDF膜（聚偏二氟乙烯） 尼龙膜、滤纸条 在膜上对蛋白质进行定性分析及定量检测 蛋白转印方法： 简单扩散、真空助溶液流、电洗脱 包括半干式转移、湿式转移等方法。 将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极。 滤纸 凝胶 转印膜 转移单位示意图 负极（上盖） 蛋白质转移方向 正极（石墨板） 取下含目的蛋白的凝胶，于转移缓冲液中平衡 15 min 用蒸馏水清洗石墨板、擦干 在石墨板（＋）上依次放置3张滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、3张滤纸 扣上转移电泳槽上盖（－），恒流下转移，0.8mA/cm2，15 min 关闭电源，取出膜，紫外灯下检测。 1条膜／组 * * 本实验以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）为实验材料，通过免疫印迹杂交方法分析GFP在大肠杆菌中的表达