11北京市自然科学基金项目张海东申请书 - 中国政法大学证据科学 .doc

所属学科组 资助编号医药科学 基础医学 7132116北京市自然科学基金任务书项目 项目名称： 甲基苯丙胺急性中毒大鼠心肌表达差异性蛋白初筛 ： 张海东 依托单位： 中国政法大学 资助金额： 14 起止年月： 20131至201512 填写日期： 2013-04-11 北京市自然科学基金委员会 2013年填表说明一、填报书前，请），查阅市自然科学基金的有关规定认真书各项内容，要求实事求是表达明确。外来语应用中文和英文同时表达，第一次出现的缩写词，须注出全称。书为A4纸，书正文要求宋体5号字，双面打印，于左侧装订成册，一式份（为原件），报送北京市自然科学基金委员会办公室。用阿拉伯数字表示，以万元为单位，小数点后取两位一、简表信 息 姓名（中文） 张海东 姓名（拼音） zhang hai dong 性别 男 民族 汉族 出生 1969-11-10 电子邮箱 haidongzh@ 办公电话手机 专业技术职务（职称） 副教授最高学位 硕士 最高学位授予单位 华中科技大学 研究领域 法医学 依 托 单 位 单位名称 中国政法大学 单位类别 高等院校 隶属关系 中央 邮政编码 100088 通信地址 北京市海淀区西土城路25号办公楼 联系人 满学惠 联系电话 传真电子邮箱 xuehuim@163.com 合 作 单 位 单位名称 联系人 联系电话 项 目 基 本 信 息 项目名称（中文） 甲基苯丙胺急性中毒大鼠心肌表达差异性蛋白初筛 项目名称（英文） Primary Differential Expressing Proteins Screen Test of Myocardiocytes of MA-Induced Rats 申报学科1（名称） 法医毒理、病理及毒物分析 申报学科1（代码） H2301 申报学科2（名称） 申报学科2（代码） 依托实验室 部门开放 起止年月 20131 至201512 研究性质 基础研究 14万元 医药科学 基础医学二、任务书正文 （）研究内容研究目标 主要研究内容 二维电泳-质谱的技术路线 建立大鼠MA急性中毒模型（急性组、对照组），观察中毒大鼠心肌细胞的组织病理和超微病理变化。 制备蛋白质样品。包括细胞裂解、蛋白质溶解及去除核算等非蛋白质成份，丙酮沉淀法纯化蛋白质，采用BCA法测定蛋白质浓度。 双向凝胶电泳通过（Two-dimensional electrophoresis, 2-D PAGE）将蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离电泳后对胶进行高灵敏度的考马斯亮蓝染色利用凝胶图象分析系统成像技术比较样品之间蛋白质表达的异同感兴趣的蛋白质点进行定位。通过蛋白质点切割系统，将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割，对胶中蛋白质进行酶切水解消化，由于每种蛋白质的氨基酸序列不同，产生的肽片段序列亦不相同，其肽混合物的质量具有特征性，peptide mass fingerprinting，PMF）在质谱（Mass Spectrometry, MS）系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据拟解决的关键问题 研究匀浆组织制备蛋白质样品，2-D PAGE分离蛋白质时，由于蛋白丰度不同，得到的蛋白图谱分辨率低，效果不理想，重复性和稳定性较差。本项目突破传统方法的局限性，增加了丙酮沉淀法纯化蛋白质的过程，对样本预处理方法进行了调整和优化，。2-D PAGE分离后的蛋白质点经显色后才能被鉴定。常用染色方法有银染和荧光染色，其中银染灵敏度可达l ng，灵敏度最高。但银染凝胶的质谱鉴定较难，附着在凝胶基质上的肽片段胶内提取效率较低，因此，本课题拟用银染寻找差异蛋质点，再加大上样量，进行考马斯亮蓝染色，结合胶内酶切提取鉴定蛋白质。 NRDB、dbEST数据库中检索外，同时考虑到瑞士的SWISS-PROT数据库拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库，故也将其纳入检索范围，最大化的分析心肌蛋白表达谱，为今后相关研究提供重要的数据。 （二）研究方案 研究方法及实验手段 NRDB、dbEST和SWISS-PROT数据库中进行检索。 根据差异蛋白质的种类进行相关调控因素的研究。结合上述蛋白质组学研究结果，并查找文献，对其他差异蛋白质的调控因素进行免疫组化研究及RT-PCR的检测。 技术路线及关键技术 二维电泳-质谱的技术路线 第五步：探讨MA急性中毒心肌损伤形成机制。 关键技术： 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-D PAGE）筛选差异蛋白质 质谱（MS）技术定性分析差异蛋白质。 可行性分析 中国政法大学拥有