技术咨询电话：400-607-9999 克必隆g载体（magicvector g） 货号 .doc

克必隆G载体MagicVector G） 货号：M050017 产品及特点本产品是高效零背景通用（General）克隆载体,其无背景克隆原理是该载体携带一自杀基因,多克隆位点在该基因之中,自身环化的载体其自杀基因正常表达,转化细胞不能生长。只有当外源DNA插入片段打断该自杀基因的正常编码顺序,转化细胞才能生长,所以最后得到的转化子几乎都是含有插入片段的重组子。 零背景,阳性率一般为95%,不用蓝/白筛选,尤其适合于构建文库用。 适用于绝大部分常用的E.Coli菌株,而市场上的同类产品一般都需要特殊的菌株作宿主。 克隆步骤简化,可一小时内即可完成。载体无需完全酶切，无需去磷酸化,无需要纯化片段。 多拷贝复制起始位点(ori),便于大量制备质粒。 质粒用量仅为常规方法的1/5。 规格及成分 成份 5 ug包装 克必隆G载体DNA 5 ug 选择液,1000X 1.5 mL 使用手册 1份 质粒信息一：质粒图谱 二:克隆位点 t3 promoter sacI SacII 690 AATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTggagctccaccgcgg TTAATTGGGAGTGATTTCCCTTGTTTTCGACCTCGAGGTGGCGCC NotI XbaI Spe I SmaI 740 tggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaatt ACCGCCGGCGAGATCTTGATCACCTAGGGGGCCCGACGTCCTTAA HindIII ClaI SalI Xho I 790 cgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccgg GGTATAGTTCGAATAGCTATGGCAGCTGGAGCTCCCCCCCGGGCC KpnI T7 promoter tacccaattcgccctatagtgagtcgtatta ATGGGTTAAGCGGGATATCACTCAGCATAAT 运输及保存4℃运输，-20℃保存 使用方法G载体的转化和保种 感受态细菌转化法见分子克隆手册等参考书。 常态转化（需要使用的克必隆常态转化液） 标记无菌的1.5 mL塑料离心管并加入1 mL 液体培养基（如SOC或LB）。 用接种环,无菌牙签或吸头从培养皿上挑取1-3个划盘过夜生长的DH5α，DH10B或HB101等常见的E. coli菌落到无菌离心管中，菌落直径在3-5 mm之间（如果直径太小，可以适当多挑几个）。用移液枪轻柔吹打散开。如果使用甘油菌种保存液,则直接取50 uL菌种液到1 mL 培养液中。 37℃保温1小时。 室温10000 g离心1分钟后小心移弃上清(培养基), 离心速度低于10000 g则细菌沉淀易丢失。沉淀的细菌约芝麻或麦片大小为宜。 短暂离心, 用移液枪小心将残留的培养液(约50 uL)吸出，否则残留培养基将会严重影响转化效率，故此步一定不能省略。 加入50 uL冰浴的克必隆转化液并小心将细胞轻柔吹打均匀。 在样品管中加入1-10 uL克必隆G载体DNA并轻柔吹打均匀。 将上述离心管置于-20℃直到液体凝固为止（20分钟），然后置于冰浴5-10分钟。 在离心管中加入1 mL无抗菌素的 SOC或LB培养液，混匀后置37℃水浴保温1小时。 将溶液充分吹打混匀后分别取100 uL涂于含50 ug/mL Amp的培养盘上和含50 ug/mL Amp+选择液(1X)的培养盘上，剩余转化最好留4℃以备再用。 37℃ 16-24小时培养, 含Amp的培养盘上将有大量落菌出现, 这些菌落自杀基因已经表达，只是由于没有选择液，细菌没有被杀死。含Amp+选择液 (1X) 的培养盘上的菌落数不到前者的10%，表明90%以上的菌落在有选择液存在时被杀死（残留的菌落都是自杀基因发生了突变的突变子）。由于选择液里面的特殊成分，含选择液盘上的菌落成红色，但对DNA和细菌没有任何影响。 选择Amp盘上的菌落保种（具体操作见分子克隆手册等参考书） G载体在克隆中的使用 1．需要特殊准备的材料 选择培养基：在倒LB平板之前将Amp (自备)和选择液（附赠）按比例加入到LB之中使Amp 的终浓度为50 ug/mL, 选择液的终浓度为1X, 摇匀后倒盘。其他准备工作同普通克隆工作。 2．连接反应 取新的经过灭菌处理的0.5 ml Eppendorf管, 编号。 将酶切后的G载体0.1-1 μg转移到无菌离心管中，加两倍摩尔量的外源DNA片段，折合成重量(ng) = (外源DNA片段bp数