华中科技大学生命科学与 - 生命科学与技术虚拟仿真试验教学中心.ppt

* 高产SOD微生物 1994年北微所张博润等人经单倍体分离、诱变和群体杂交等手段选育到1株ＳＯＤ高产酵母菌ＺＤＦ 48,ＳＯＤ产量为1350Ｕ/ｇ湿菌体，对其进行培养条件优化后,产量提高至2075Ｕ/ｇ湿菌体 2000年王岁楼等人从活性干酵母中提取ＳＯＤ,其产量可达1079Ｕ/ｇ,在优化培养条件下,ＳＯＤ产量可达1948Ｕ/ｇ菌体,发酵液产酶能力为7.7万Ｕ/Ｌ发酵液 2000年迟乃玉等人从200多株不同种属的乳酸菌中筛选到1株产量较高的菌株Ｓ 898,经复合诱变,在优化培养条件下,ＳＯＤ产量高达9100Ｕ/ｇ湿菌体 ， 螺旋藻被称为“人类营养微型宝库” 其中含有Fe-SOD是一种极好的SOD材料来源 据测定每10g新鲜螺旋藻干物中，即含有100000-375000单位的活性SOD。由于螺旋藻的细胞壁极薄且柔软，给细胞破碎和胞内物的充分释出提供了极大的方便 .这就使螺旋藻在提取设备和生产成本上明显优于其它植物，因而极适于工业放大，开发前景十分广阔。 3、理化特性 SOD系一种酸性蛋白质,较稳定,能耐热。pH7.6～9时稳定,pH6以下和12以上不稳定,特别是pH2以下极不稳定 螺旋藻中存在Fe-SOD而不含其他类型的SOD,故从螺旋藻中分离纯化Fe-SOD最为理想。 螺旋藻Fe-SOD的亚基分子量约为21kD，在紫外区279nm有最大吸收值，55°C以下酶活力基本无损失 ，65°C时保温10min后酶活仅残留约20%。 4、SOD活性分析方法 邻苯三酚自氧化法（325nm法） NBT光还原法 黄嘌岭氧化酶法 邻苯三酚自氧化法测定SOD活性 邻苯三酚在酸性环境中稳定。但在弱碱性环境中会发生自氧化反应，邻苯三酚在自氧化时只接受一个电子生成超氧阴离子自由基(02十02-.)，并在其自氧化过程中以一定速率产生有色中间产物，SOD可以将02-.歧化分解成H202和02，从而抑制了邻苯三酚的自氧化速率。 202-. 十2H+ SOD H2O2十02 由此可以依据SOD分解02. 的能力而间接推算SOD的活性(每分钟反应液中SOD抑制50％反应速率时即为SOD活力单位)。SOD最低检测浓度可达10-10-10-11mol/L。 NBT光还原法测定SOD活性 核黄素在光照时产生 O 2 - . ,NBT被 O 2 - .还原为蓝紫色物质（formazan）， 这种物质对 530～ 580 nm均呈现最大吸收 ,SOD存在时 ,NBT还原反应受到抑制。 NBT光化还原法的反应液稳定性较差 ,只需见光便快速反应 ,因此反应液只能现做现配 ,且各个试剂必须避光保存。 核黄素在只有在光照的条件下才会释放出超氧阴离子 ,因此用 NBT光化还原法时起动反应容易控制 ,用 NBT光化还原法光照反应只需 2 0分钟 , 黄嘌岭氧化酶法测定 SOD的活性 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基 (O 2 - . ) ,后者氧化羟胺形成亚硝酸盐 ,在显色剂的作用下呈现紫红色。用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含 SOD时 ,则对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用 ,使形成的亚硝酸盐减少 ,比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值 ,通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。 测定方法 :参照 SOD测试盒说明书。 酶活力单位 :每克蛋白在 1 ml反应液中 SOD抑制率达 50 %时所对应的 SOD量为一个 SOD活力单位 (U) 四种方法之间酶活力换算 　 根据四种不同方法对 SOD酶活力测定的结果进行换算 ,420 nm法 1个活力单位相当于 325nm法 2.41～ 2.66个活力单位 ; 微量 Vc终止法 5.1 1～ 5.78个活力单位 ; DTT终止法 0.98～ 1.06个活力单位 。 求出 4种方法之间的换算系数 (CC) 325nm/ 420 nm近似 2.5; Vc/ 420 nm近似 5.5; DTT/ 420 nm近似 1.0 . 方法重现性 由同一操作者在同一台分光光度计上 ,用四种不同的 SOD酶活力测定 ,以减少操作者和仪器的误差 ,测定酶活力时严格控制反应条件 .反应数据分析表明: 420 nm和 DTT终止法的反应误差均小于 2%, 325nm和微量 Vc终止法的反应误差近 4%. 这是由于 325nm和微量 Vc终止法 SOD样液与邻苯三酚加样量