绒山羊联会复合体蛋白3基因（scp3）的克隆.docVIP

附件2 论文中英文摘要格式 作者姓名：侯 越 论文题目：绒山羊联会复合体蛋白3基因（Scp3）的克隆、转录表达及其多克隆抗体的制备 作者简介：侯越，男，1984年02月出生，2006年09月师从于内蒙古大学吴应积教授，于2009年07月获硕士学位。 中 文 摘 要 联会复合体(synaptonemal complex, SC)发现于约半个世纪前，是一种呈框架状结构的蛋白质复合体,在进化上十分保守,见于绝大多数物种的减数分裂中。联会复合体蛋白质( synaptonemal complex protein, SCP)的表达具有严格的时间和空间特异性:它出现于减数分裂Ⅰ前期的细线期(leptotene),消失于双线期(diplotene);SC与染色体的凝缩,同源染色体的配对、重组以及双链断裂( double-strand break, DSB)的形成有关。正是由于SC在减数分裂Ⅰ中所扮演的关键角色,因而认为它的结构和功能以及其编码基因的异常必将影响生殖细胞的正常发生,国内外均对SC进行了深入的研究。 已经发现的SC及其编码基因的异常可导致精子发生障碍。SCP3纯合失活的雄性小鼠精母细胞中不能形成成熟的SC,生精过程停滞在减数分裂Ⅰ前期的偶线期之前,同时这些突变细胞多发生凋亡,从而导致雄性小鼠无精症和不育,但SCP3杂合性失活的雄性小鼠生育力不受影响。与之形成对比的是:在缺乏SCP3的雌性小鼠虽然也不能形成AE /LE,但其卵细胞减数分裂基本不受影响,仅有生育能下降和胚胎非整倍体细胞增加。 减数分裂作为精子发生过程中一个特殊阶段一直是男性原发无精症研究中的热点,而SC因为其在减数分裂中所扮演的重要角色已成为研究的重点。在已知的SC蛋白及其编码基因中,迄今除已证实SCP3单碱基杂合性缺失可直接导致无精症外，其他基因如SCP1, SCP2, FKB P6变异是否导致无精症,尚未见报道。对于Scp3的研究也仅仅停留在小鼠和人上，其他动物的研究并未开展，特别是大型哺乳类家畜的研究很少，例如牛、羊，主要原因就是取材方面的困难，这样就直接影响了牛、羊的精子发生过程的研究，特别是确定牛、羊在青春期前第一次减数分裂的时间点对于整个研究工作的开展尤为重要，而SCP3恰恰是一个可以在第一次减数分裂特异表达的基因，而到目前为止羊的SCP3的基因编码区的全序列还没有报道，这就严重影响了对羊SCP3基因的研究及其后续工作的开展，本研究从这点作为切入点，选取内蒙古自治区特有的家畜阿尔巴斯绒山羊为实验材料 ，克隆绒山羊SCP3基因编码区的全序列，同时对早期绒山羊个体SCP3基因的表达也进行了初步探讨，为更好的研究大型哺乳类家畜特别是绒山羊做好前期的物质准备。 本研究对绒山羊SCP3 的基因序列进行了克隆和测序，并对其在早期个体中的转录水平进行了研究，最后制备了该基因产物的抗原表位多肽，并制备了多克隆抗体。首先，分别比较了人、大鼠、小鼠、牛的Scp3 的序列，根据序列同源性设计相应引物，并利用绒山羊睾丸组织的cDNA 作为模板，通过RT-PCR扩增得到Scp3 基因890bp 的序列片段，将扩增的产物连接到pMD-19T 载体中进行测序，将所得的序列利用BLAST 软件进行分析，结果表明，克隆的绒山羊Scp3 的序列与牛的同源性可达95%以上，并且与人、小鼠、大鼠的序列相比也具有较高的同源性，通过比对确定克隆到的序列已包含了从起始密码子到终止密码子的编码区的所有序列。 从鄂尔多斯绒山羊生物技术繁育中心现场取得内蒙古白绒山羊新鲜的睾丸组织块，将睾丸组织块（将组织块大小控制在30～50μg）放入冷冻管后立即入液氮保存，带回实验室后置于-80℃冰箱保存备用。 从山羊睾丸组织分离山羊总RNA，利用Watson总RNA提取试剂盒（Watson’s Handbook for RNA Isolation Purification version 2.07）并按照使用说明书的操作程序提取山羊睾丸组织总RNA，进行紫外测定RNA浓度后置于-80℃冰箱保存备用。然后，利用TaKaRa的M-MLV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA第一链。以得到的cDNA第一链为模板，以下面所列的P1、P2为引物，利用TaKaRa Taq DNA聚合酶进行PCR反应。PCR反应体系为10 μl： 模板cDNA 1 μl，P1，P2 0.2μl， TaKaRa Taq(5U/μl) 0.2μl, MgCl2（25mM）0.4μl，10×PCR Buffer（Mg2+ Free）1μl,dNTP dH2O 6.8μl；扩增条件为：94℃ 预变性4分钟;94℃变性 40秒,56℃退火 40秒, 72℃延伸 1分钟,共进行35个循环;72℃ 10分钟 。 以三个月的绒山羊