第一节核酸的凝胶电泳-生物探索.ppt

Agarose gel electrophoresis 二、 分类－琼脂糖凝胶电泳（RNA变性凝胶电泳） RNA由单链核苷酸组成，其局部可形成双链的二级结构或三级结构。因此欲测定RNA较准确的分子大小，必须在变性条件下进行电泳。其他同DNA电泳。 RNA变性条件下进行电泳，所使用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺。尿素和甲酰胺通常用于RNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因为它们会影响琼脂糖固化。在琼脂糖凝胶电泳时，用选择就是前三种。 用甲醛变性电泳后若需将核酸转移至硝酸纤维素膜上(如Narthern等)核酸需再经NaOH变性，控制不当易断裂RNA，甲醛还有强烈的刺激性气味。羟甲基汞是最理想的变性剂，但毒性大。因此，一般均选用乙二醛作变性剂。 1、乙二醛的处理 商品乙二醛为40%溶液(6M/L)。乙二醛中含少量的，乙二酸、乙醛酸和甲酸等氧化物。使用前必须经强碱强酸混合型树脂去离子，否则会把RNA降解。反复处理直至溶液pH值大于5.0为止。然后分装小份。 3、染色 染色最好能够用30μg/ml吖啶橙浸胶。尽量少用或不用溴化乙锭，因为乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，改变溴化乙锭的光谱性质。绝对应禁止将溴化乙锭灌注胶内。 1.5%琼脂糖分析小于1kb的RNA，1%琼脂糖分析大于1kb的RNA分子。电泳缓冲液应为10mM磷酸钠电泳液。 4、锚定PCR (anchored PCR) 扩增序列未知或其序列未全知的DNA序列锚定通常要获知一个引物方好些，这个引物必须是已知特异的。 锚定引物poly(dc)，其模板poly(dG)用末端转移酶加到单链DNA上去。 5、多重PCR (multiplex PCR) 基因太大，同时检测多个位点。因此分成几个区域来分别检测。如进行性肌营养不良症(DMD) 2000kb，视网膜母细胞瘤基因有数百个kb。还有如Genetyping，微卫星。 To be continued.….... 变性、退火、延伸三步曲 变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 PCR反应的温度循环周期 Typical PCR Thermal Profile *This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得—230个基因片段 Reaction Condition for a Typical PCR Assay Some DNA Polymerases Used in PCR Characteristics of Taq Polymerase 与待扩增的靶DNA区段两端序列（5’端）互补，的人工合成的寡核苷酸片断。 PCR引物 a.其长度通常在15～30个核苷酸之间。 419＝2.75X1011, 人类基因组长度3X109. b.3’端碱基必须与模板互补（5’ 3’延伸方向） c. G＋C含量50%～60%，嘌呤、嘧啶避免连续排列，一 对引物之间不能有2个以上的碱基互补，防止引物间产生引物二聚体，避免回文序列。 d.退火温度低于引物本身Tm值5℃。 PCR技术的特点: 1.特异性强 2.敏感性高 3.快速 4.简便 5.可扩增RNA和cDNA 6.对起始材料要求低 7.有一定程度单核苷酸碱基错误掺入 PCR扩增的长度：2kb 特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 生物样品 DNA片段 基因诊断 基因治疗 基因工程产品 法医学检测 人类学研究 …… 二、 PCR技术的应用 1、 反相PCR(reverse PCR