亚胺培南、头孢吡肟、头孢曲松和氨曲南对阴沟肠杆菌AmpC酶的诱导性分析.pdfVIP

中文摘要 刖 置 i随着8～内酰胺类抗生素在临床上的广泛应用，革兰阴性杆 菌的耐药性日益突出，常导致难治性医院感染。革兰阴性杆菌产 生耐药性的最主要机制是这些细菌产生了能水解B一内酰胺环的 B一内酰胺酶。其中，最受关注的是染色体介导的AmpC酶和质 粒介导的超广谱B一内酰胺酶。近年来，质粒介导的AmpC酶的 出现，大大提高了AmpC酶横向传播能力，使院内感染愈加难以控 制。因此，如何防治AmpC酶、降低细菌的耐药率，成为国内外学 者关注的焦点。 AmpC酶属于Bush—J—M1群，是由革兰阴性杆菌产生的不 被克拉维酸抑制的头孢菌素酶，对头孢菌素类抗生素的水解率大 于对青霉素类的水解率。大部分革兰阴性杆菌如阴沟肠杆菌、弗 劳地枸橼酸杆菌、粘质沙雷氏菌及铜绿假单胞菌等都可以产生染 色体介导的AmpC酶而对第三代头孢菌素包括头孢他啶、头孢曲 松、头孢噻肟和氨曲南耐药。AmpC酶根据能否被B一内酰胺抗 生素诱导分为诱导性AmpC酶和非诱导性AmpC酶。，阜 i 高产AmpC酶的细菌引起的医院感染使我们的临床治疗面临 着严峻的考验。对阴沟肠杆菌来说，仅高产AmpC酶就足以造成 高水平B一内酰胺耐药性。近年来头孢菌素的广泛使用和其对阴 沟肠杆菌的选择作用，使阴沟肠杆菌迅速成为严重医院感染越来 越重要的病原菌。本实验通过比较在体外条件下不同浓度的亚胺 培南、头孢毗肟、头孢曲松和氨曲南对阴沟肠杆菌诱导产AmpC酶 活性的差别，同时对诱导实验后的耐药株进行ampD基因的扩增、 测序，以确定是否存在突变。b希望通过上述研究为临床合理应用 抗生素、预防及控制AmpC酶的诱导合成提供一些参考。 实验材料与方法 实验材料 一、菌株来源 实验所用菌株为我院呼吸病房(包括RICU)2000年6月一 20E 2002年6月分离的25株阴沟肠杆菌，所有实验菌株均以API 系统进行鉴定。标准菌株E．cloacae029M、029、1194E由北京协 和医院细菌室惠赠。 二、实验试剂 (FEP)、头孢西丁(FOX)、克拉维酸干粉、头孢唑林、青霉素、氯唑 西林。M—H琼脂，两性电解质载体(PH3．5—10，)，考马斯亮兰 (G250)，碘，碘化钾，丙烯酰胺和N，N’一亚甲双丙烯酰胺，Taq 酶、Taq酶缓冲液和dNTPs，琼脂糖和溴化乙啶。 三、实验仪器 电热恒温培养箱，低温高速离心机(rosA)，752紫外可见分光 光度计，水平电泳仪，LKB2117等电聚焦系统，DNA扩增仪。 实验方法 一、标本来源 院的下呼吸道感染患者的合格痰标本及防污染毛刷刷取的气管内 分泌物标本。 二、药敏实验 采用纸片扩散法及E—test试条进行药物敏感性及MIC值检 测，按1999年美国临床实验室标准委员会NCCLS操作规则进行。 三、头孢西丁诱导实验 分别对第三代头孢菌素敏感(包括中介)或耐药的菌株进行 头孢西丁诱导实验。通过测定诱导前后的酶活性以筛选出野生 ．2． 型、高诱导型和去阻遏型菌株。 四、阴沟肠杆菌AmpC酶的诱导性实验 对头孢西丁筛选出的野生型和高诱导型菌株各5株(包括2株标 准菌株E．cloacae029和E．cloacael 194E)进行AmpC酶诱导性实 验。 五、13一内酰胺酶的提取 六、AmpC酶等电点测定及抑制实验 用LKB2117等电聚焦系统测定B一内酰胺酶的等电点。电 抑制实验。 七、AmpC酶活性测定 用紫外分光光度计分别测定加入酶提液前后头孢唑啉在 化，最后计算其平均每分钟吸光度降低值。 八、三维试验及突变率测定 根据三维试验阳性的细菌株数，计算抗生素筛选后高诱导菌 株的突变率。突变率=0．69木(mt—m0)／(nt—nO) 九、模板DNA的制备 十、ampD基因的PCR扩增 十一、ampD基因的测序和序列分析