实验二萌发小麦水溶性蛋白含量测定预习报告.docxVIP

生物化学实验预习报告实验二酶活力测定方法的研究（2）——萌发小麦水溶性蛋白含量测定一、研究背景酶比活力（性）是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质（或RNA）所具有的酶活力单位数。比活力（Specific Activity）是酶纯度的量度，一般用IU/mg蛋白质来表示，通常酶的比活力越高，酶就越纯。人们利用比活力的大小来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，作为酶纯度高低的一个重要指标。在实验一中，我们学习并掌握了蛋白质含量的基本测定方法及分析，实验二的第1部分我们又测定了酶的活力，学习了定量检测某种酶的策略和方法。在本次实验中，我们依然通过分光光度法测定蛋白质的含量，结合酶活力的测定结果，便可得出酶的比活力，从而对特定生物样品的单位质量蛋白质中特定酶的催化能力有一个初步的认识。二、研究目标1.进一步熟练使用分光光度法测定蛋白质浓度；2.掌握酶比活力测定的一般思路及方法；3.测定萌发小麦α-淀粉酶与β-淀粉酶的比活力。三、研究策略首先测定出α-淀粉酶与β-淀粉酶的活性（实验二第1部分已测），然后采用Folin-酚法测定出水溶性蛋白的总含量，通过计算便可分别得出α-淀粉酶与β-淀粉酶的比活力。四、研究方案与可行性分析1.研究方案（1）酶的获取材料为实验二第1部分所取萌发的小麦种子研磨浸提得到初始酶液。（2）α-淀粉酶与β-淀粉酶活力测定实验二第1部分已经完成。（3）水溶性蛋白总量测定采用Folin-酚法测定水溶性蛋白的总含量。首先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测定其吸光度值，从而绘制出标准曲线。随后测定初始酶液的吸光度值，从标准曲线上即可读出初始酶液中蛋白质含量。（4）酶比活力的计算酶的比活力（U/mg）＝酶活力（U/mL）/ 蛋白浓度（mg/mL）2.可行性分析就实验本身而言，通过测定酶活力以及总蛋白含量计算酶的比活，方案合理，简便易行，具有可操作性；实验材料（萌发小麦种子）可在实验室获得，Folin-酚试剂甲和乙、分光光度计实验室均可提供；实验所用时间约为4h（下文会粗略计算），可在规定时间内完成，故时间上有可行性。综合以上各点，本实验具有可行性。五、具体实验设计1.实验仪器及试剂722型光栅分光光度计、具塞刻度试管、微量可调手动移液器、蒸馏水、Folin-酚试剂甲、Folin-酚试剂乙、标准牛血清白蛋白溶液（1mg/ml BSA）、待测样液（初始酶液）2.实验步骤（1）待测样液（初始酶液）的制取（实验二第1部分已做，30min）（2）α-淀粉酶与β-淀粉酶活力测定（实验二第1部分已经完成，2.5h）（3）Folin-酚法测定水溶性蛋白的总含量250μg/ml BSA的配制（1h）用移液器量取1mg/ml BSA3ml，随后加入9ml蒸馏水，颠倒之后混合均匀即可。蛋白质含量的测定管号123456789250μg/ml BSA原液（ml）00.20.40.60.81.0待测样液各1mldH20（ml）1.00.80.60.40.20试剂甲各5ml，混匀，RT（室温）10min试剂乙各0.5ml，立即混匀，RT：30min（2h之内稳定）0D650（4）酶比活力的计算规定淀粉酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（mg麦芽糖·min-1·g-1鲜重），即1U=mg麦芽糖·min-1·g-1鲜重。α-淀粉酶的比活力（U/mg）＝α-淀粉酶活力（U）/[初始酶液体积（ml）×蛋白浓度（mg/mL）]β-淀粉酶的比活力（U/mg）＝β-淀粉酶活力（U）/[初始酶液体积（ml）×蛋白浓度（mg/mL）]3.注意事项及误差分析Folin-酚法测定蛋白质含量时，由于反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。另外，加入试剂乙后应该立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前还原反应即能发生，否则会造成测量误差，使其OD650下降，测定结果偏低。六、质疑与思考本实验在测定水溶性蛋白质含量时，为什么要选用Folin-酚法？在实验一我们用三种不同的方法测定了生物材料中蛋白质的含量，最终的结果其实相差比较大，但我们也不能够断定到底哪一种方法是准确的。在本实验中，由于核酸等物质的干扰，紫外法测定蛋白质含量的结果必定会受到较大的影响。但为什么本实验不用考马斯亮蓝（G-250）法而使用Folin-酚法呢？生化课本上说Folin-酚法是测定可溶性蛋白的标准方法，但我们知道，Folin-酚法操作费时且抗干扰能力很差，K+、Na + 、Mg2+离子、Tris缓冲液、蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均会对其产生干扰，而K+、Na + 、Mg2+这些离子在生物体内含量也是比较高的，肯定会对测定结果的准确性有一定的影响。相比较而言，考马斯亮蓝（G-250）法灵敏度更高，操作快速简便，抗干扰能力强，应该具有更强的可选择性。个人猜想