水稻内生细菌的分析及其杀虫工程菌的构建.pdfVIP

日¨ 口 水稻是我国的主要粮食作物之一，每年因病虫害造成的产量损失可达20％以上， 病虫害危害严重的年份，产量损失可达45％。生产上，主要使用化学农药来防治水 稻病虫害，但化学农药对环境、人类的健康造成严重的破坏和负面影响，并使有害生 物抗药性逐年提高，生态平衡日益恶化。所以无公害、环保的生物农药越来越受到人 们的关注，但部分生物农药，特别是一些高效杀虫、防病的蛋白类生物农药在生产上 容易受到环境因子的影响，应用时其稳定性与高效性的结合受到了一定的限制。所以 应用环保、高效、稳定的新型方法来防治农作物病虫害，已经受到研究人员的普遍关 注。 Bacteria)是指能长期定殖在健康植物组织内，与植物建立 植物内生细菌(Endophytic 和谐联合共生关系的一类特殊细菌。它可以提供部分植物所需的营养物质和激素，参与 植物的防卫功能，又可以从植物体内获得充分的生长物质，受到植物的保护，使其免 受外部恶劣环境的影响。基于内生细菌在植物体内生长，不受外界环境因子影响这一一 特点和独特的优势，其作为一种潜在的生物防治载体，用来构建高效、稳定、广谱杀 虫抗病的生防工程菌株而加以利用的策略，近年来受到了国内外植物学家、微生物学 家、生态学家的广泛重视。 因此，本研究在四川稻区开展了对水稻内生细菌的研究。广泛调查内生细菌在栽 培水稻植株体内动态分布，以及不同水稻生育时期、不同组织器官的内生细菌种类、 数量动态变化，反复验证确定优势菌株及其内生性，并试图将优势内生细菌作为载体 与杀虫、抗病基因进行高效重组，赋予内生细菌新的功能。期望将重组后的工程生防 内生细菌应用于水稻病虫害的防治中，为新型、高效、稳定的生物农药的研究和开发 打下基础，并为生物防治提供丰富的理论基础。 水稻内生细菌的研究及其杀虫工程菌的构建 摘 要 本研究从四川主要栽培水稻品种D优527体内共分离到102株细菌。研究了内生细菌 在水稻植株内不同生育期、不同组织部位的动态分布曲线特点，确定编号为sR一15、sR-25、 sL．37的三株细菌为优势菌株，并进行了优势菌株的回接、定殖试验，验证其内生性。经 生理、生化特性结合形态学的研究，确定了优势内生菌株在微生物学上的分类地位，并进 行了与Bt杀虫蛋白基因的重组，以及杀虫蛋白基因的表达及对水稻二化螟防治研究，验证 了优势内生细菌作为生防工程载体菌的可行性。此外，对菌株的致病性、促生性等生物学 特性进行研究。 取得的主要结果如下 l 利用改进的细菌分离技术，从健康栽培水稻品种D优527的植株体内共分离到102 株细菌，从根系中分离到41株，从叶片分离到37株，从茎分离到24株。其中，革兰氏 果显示，菌株基因组间存在多态性。 2对所获得菌株进行种群、数量的动态分析，研究细菌在根、茎、叶内随水稻生育 期变化的动态分布情况，其中，水稻分蘖期和孕穗期是细菌种群数量分布的高峰时期。 s艮15在分蘖期和孕穗期数量分布高于其它两菌株。 符合细菌生长的典型的生长曲线，在不同pH、温度、培养基条件下，菌株生长的动态变化 各有差异，且与相关报道的内生细菌生长特性具有一定的相似性。 5转pucl8标记验证内生性试验结果表明，在不同电压下，电击转化细菌的效率不同， 在电压为1500V时转化效率最高，而pucl8使用量对转化效率影响不明显。转带抗生素标 记的pucl8于优势细菌，回接水稻再分离，在抗生素培养基上初步筛选和PCR鉴定，与原 始菌株一致。并通过电子显微镜超薄切片确定了各菌株在水稻体内的存在部位。验证了 SR·15、SR一25、SL一37皆为水稻内生细菌。 为浅黄金杆菌。 8应用改进的PEG原生质体转化法和新型高效电击转化法，将含杀虫毒性强的苏云金 IAc的质粒导入载体菌SR一15，构建杀虫工程内生细菌，并用电镜 杆菌6．内毒素基因Cry 观察到基因表达后产生的毒蛋白晶体。 浸水稻幼苗，并饲养水稻二化螟幼虫，6天后其校正死亡率达80．1％。 关键词： 内生细菌 优势种群 ERIC．PCR 回接验证 重组