糖凝胶电泳.pptxVIP

琼脂糖凝胶电泳检定质粒DNA; 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界面电泳不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶电泳，其优点主要在于操作简单、快速、灵敏。 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA、RNA分子混合物的方法，以琼脂糖作为支持介质，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的 ;实验原理;主要实验器材;琼脂糖Agarose（AG）：从石花菜及其他红藻类植物提取出来的一种线状高聚物，由1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链构，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶; 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，是一种荧光染料。EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光,荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。同时EB也是强致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 ;琼脂糖凝胶中DNA的观察;上样缓冲液（Loading Buffer）：0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青；30％甘油水溶液 作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 ③使样品呈色，使加样操作更方便 ; 电泳缓冲液：指在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE等;实验操作;（1）制胶（以30 mL1%琼脂糖凝胶的为例） a. 称取0.3 g 琼脂糖，加入30 ml 的1×电泳缓冲液摇匀；;溶 胶;待凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml，混匀;铺 胶;;向电泳槽中加入0.5x电泳缓冲液至刚没过凝胶表面1~2mm;;（3）电泳：打开电源开关，调节电压至80V, 可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约25分钟即可观察结果。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳（??溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳）。 ;（4）观察： 将电泳好的胶置于凝胶成像系统上，打开紫外灯，可见橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。;附 注：;4)?琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA; ;注意事项