噬菌体生命周期溶源周期：噬菌体dna整合到寄主细胞染色体dna上.ppt

第五章 噬菌体载体和柯斯载体 1.噬菌体的概念 专门侵害细菌和放线菌等微生物的病毒称为噬菌体（phage）。 从形态学角度又可将其分为三种不同的基本类型。 有尾部结构的二十面体型： 1、2、3群都有尾部，1群具有收缩性的尾鞘，2群有长的非收缩性的尾部，3群的尾部很短， 无尾部结构的二十面体型：4、5两群没有尾部，两者的区别是4群外壳顶端蛋白质衣壳粒较大，5群则较小， 线状体型：6群为纤线形的噬菌体， 病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。 分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒： 溶原性增殖→构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖→改造后 噬菌体的结构特点 噬菌体的构造形式如图,头部呈现六角晶柱形，经过染色处理和高度放大，可观察到头部呈20面体的结构，由蛋白质组成其外壳，内含核酸。 尾部由一个中空的管状体尾髓和可收缩的蛋白质尾鞘所组成。与头部相接处呈现收隘部分，称为颈部。尾端具有六边形的基片，其上生出六个刺突，并缠绕着六根细长的尾丝。 噬菌体的化学成分 噬菌体的化学组成，绝大部分是核酸和蛋白质，占病毒粒子重量的90%以上，其中核酸占40%～50%。 噬菌体按核酸类型分有DNA和RNA噬菌体。一般多为DNA噬菌体，但近年来发现有不少噬菌体所含的核酸是RNA。 噬菌体中核酸链有单链的也有双链的，故有双链环型DNA,单链环形DNA,单链线型DNA,单链线型RNA等多种形式。 1、2、3三群由双链DNA组成； 4、6群为DNA单链； 5群为RNA单链。 某些噬菌体的核酸中含有异常碱基，如大肠杆菌T系偶数噬菌体，无胞嘧啶而代之以5-羟甲胞嘧啶。某些枯草菌噬菌体的DNA中无胸腺嘧啶而代之以尿嘧啶或羟甲基尿嘧啶。 t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入； t=1 寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭； t=2 第一个噬菌体mRNA开始合成； t=3 细菌DNA开始降解； t=5 噬菌体DNA合成开始启动； t=9 “晚期”噬菌体mRNA开始合成； t=12 出现完整的头部和尾部结构； t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒； t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒 噬菌体的监测方法 噬菌体是极微小的微生物，通常在光学显微镜下不能看见，在人工培养基上又不能生长。所以，对噬菌体的监测只能用间接的方法进行。这些方法主要是根据噬菌体的生物学特性而设计的。 第一，噬菌体对寄主具有高度的特异性，可利用敏感菌株对其进行培养； 第二，噬菌体侵染宿主细胞后可引起裂解，通过观察在含有敏感菌株的琼脂平板上接种噬菌体培养后是否出现噬菌斑，或是观察在含敏感菌的液体培养基中培养物是否变清来进行判断。 常用的方法有载片快速检测法、单层琼脂法和双层琼脂法。 λ噬菌体的基因组的结构和用途 λ噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12 nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。 伴随分子生物学、分子遗传学的创立和发展过程。 DNA复制机理的阐明、转录的终止作用、连接酶和解旋酶的发现、位点特异的重组作用、SOS修复机制等，均是以噬菌体为材料取得的重要研究成果。 构建的多种噬菌体载体，广泛用于基因克隆、基因文库的构建等，是基因工程中不可缺少的实验材料。 2、λ噬菌体基因组有基因50个以上 4、 λ噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶原生长途径→某种胁迫条件下→合成six 基因产物→λ DNA脱离细菌染色体→溶菌 A,构建依据 1、λ噬菌体是一种温和噬菌体 2、能承载较大的外源DNA片段 λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点 B,构建的基本策略与技术路线 策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。 技术路线 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以g t WES – λ β为例，EcoRI（如图）。 （48.5kb） λDNA E co R I 6个片段 其中： B片段是λ噬菌体生长非必需的； C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径； E片段去掉min5序列（2.6kb）。 两端E coR I别点经点突变或甲基化处理，即得g t WES–λ β：（48.5-5.5-2.6 = 40.4kb） 克隆能力： 替换B： 最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 实际